樹鼩脊髓星形膠質(zhì)細胞的分離鑒定

王 璇， 王文廣， 李 娜， 袁 園， 張志成， 孫曉梅

(中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所實驗樹鼩標準化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團隊，云南省眼科疾病防治研究重點實驗室， 昆明 650118)

哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的功能復(fù)雜性取決于在發(fā)育過程中產(chǎn)生不同細胞類型的能力，而星形膠質(zhì)細胞是哺乳動物CNS中分布最廣、含量最多的細胞，其在形態(tài)和功能上具有多樣性[1]。星形膠質(zhì)細胞在CNS發(fā)育過程中主要負責眾多的營養(yǎng)功能[2]， 是構(gòu)成血-脊髓屏障和血-腦屏障的重要組成部分， 在維持CNS穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)損傷修復(fù)、神經(jīng)退行性疾病[3-4]、癲癇[5]、神經(jīng)發(fā)育Rett綜合征及脆性X智力低下[6]等疾病中發(fā)揮重要作用。另外， 運動神經(jīng)元的正常發(fā)育、維持以及神經(jīng)元相關(guān)的疾病都涉及神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細胞間復(fù)雜的相互作用。建立這些細胞的原代培養(yǎng)方法是理解其相互作用的關(guān)鍵步驟，也將為開展病原如何通過血-脊髓屏障的機制研究提供重要材料。星形膠質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)方法已有報道，所用動物多為雞[7-8]和鼠類[9]，且多為腦組織來源， 只有少數(shù)研究從脊髓中分離[10]。

樹鼩是一種新型的實驗動物，與非人靈長類親緣關(guān)系接近，其生理、生化、基因組和解剖學等生物學特性比嚙齒類更接近于人類，且大腦較發(fā)達，已被用于神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的研究[11-13]，但迄今尚未見到關(guān)于樹鼩脊髓源星形膠質(zhì)細胞分離培養(yǎng)相關(guān)報道。因此，探索一種操作簡便、經(jīng)濟可行的原代星形膠質(zhì)細胞分離培養(yǎng)方法，對開展樹鼩星形膠質(zhì)細胞的相關(guān)研究和豐富其實驗材料具有一定現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生1～2 d的樹鼩，雌雄不限，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心提供[SCXK(滇)K2013-0001]，實驗操作在醫(yī)學生物學研究所樹鼩種質(zhì)資源中心實驗設(shè)施進行[SYXK(滇)K2013-0001]。

1.1.2 主要儀器與試劑 A/B3(6Ft)生物安全柜、CO2T/C 恒溫培養(yǎng)箱均購自美國Forma公司; ECLIPSE Ti倒置顯微鏡購自日本Nikon公司; L8-80M 超速離心機購自美國Beckman公司; ZD-85 數(shù)顯恒溫振蕩器購自中國金壇市精達儀器制造廠; PBS、DMEM/F12 培養(yǎng)基均購自美國Hyclone公司; 胎牛血清(FBS)購自中國Excell Bio公司; 胰蛋白酶購自美國Gibco公司); D-Hank’s液、DNase Ⅰ均購自中國索萊寶公司; Poly-D-lysine購自美國Sigma公司; 鼠抗人膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(GFAP)單克隆抗體、Cy3標記的羊抗鼠熒光二抗均購自英國ABCam公司。

1.2 方法

1.2.1 脊髓原代星形膠質(zhì)細胞分離 取3只新生1～2 d樹鼩， 腹腔注射過量質(zhì)量分數(shù)2%戊巴比妥實施安死術(shù)， 于體積分數(shù)75%的酒精中消毒3 min。將樹鼩置于冰袋上，使用無菌剪刀從樹鼩背側(cè)近尾端剪開， 慢慢分離去除脊柱兩旁的肌肉組織， 獲得完整的脊柱，然后于超凈臺上取出脊髓組織， 置于預(yù)冷的含體積分數(shù)2%雙抗的D-Hank’s液中。在解剖鏡下用鑷子和剪刀小心去除脊髓外膜和較大的血管， 然后在預(yù)冷的D-Hank’s液中漂洗3～5次。用無菌剪刀將洗凈的脊髓組織剪碎約1 mm3大小，加入1 mL體積分數(shù)0.25% 的EDTA-胰蛋白酶中并輕輕吹打30 s。于 37 ℃消化 10 min， 消化至 5 min 時輕搖一次，消化結(jié)束后立即加入等量含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，然后加入1 mL DNaseⅠ(60 U/mL)， 吹打混勻，以 75 μm 的細胞篩過濾。濾液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中于4 ℃、1 000 r/min離心8 min，棄上清，用含體積分數(shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，接種于普通的T25培養(yǎng)瓶中， 在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，然后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將液體轉(zhuǎn)移至已包被右旋旋多聚賴氨酸(質(zhì)量分數(shù)0.1%)的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)， 每2 d換液1次。

1.2.2 星形膠質(zhì)細胞純化培養(yǎng) 原代培養(yǎng)至10 ～15 d， 顯微鏡下觀察到細胞長滿培養(yǎng)瓶后， 于 37 ℃、280 r/min恒溫搖床振蕩18 h，倒掉培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，加入胰蛋白酶消化3 min，細胞回縮至50%的細胞脫落后，加入等體積的含體積分數(shù)10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，用移液器吹打混勻， 1 300 r/min 離心 5 min， 棄上清，加入含體積分數(shù)10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，制成細胞懸液，接種于普通的T25培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min， 翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將液體轉(zhuǎn)移至已包被右旋多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中， 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)3次重復(fù)純化。

1.2.3 星形膠質(zhì)細胞形態(tài)學觀察 取原代培養(yǎng)和經(jīng)純化培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞，用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，并拍照記錄。

1.2.4 星形膠質(zhì)細胞免疫熒光鑒定 取24孔板， 在中間8個孔中加入細胞爬片， 并將第3代細胞接種于孔中; 將孔板中已爬好細胞的爬片用PBS浸洗3次，每次2 min; 質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，每次2 min; 0.5%Triton X-100室溫穿孔20 min; PBS漂洗玻片3次， 每次2 min; 5%的山羊血清室溫封閉30 min; 山羊血清， PBS漂洗3次，每次2 min; 滴加稀釋好的抗GFAP一抗(1∶400稀釋)，對照孔加PBS代替一抗，4 ℃過夜孵育; PBS漂洗4次，每次3 min; 避光條件下， 分別加入相應(yīng)的熒光二抗，37 ℃孵箱1 h; PBS漂洗4次，每次3 min;滴加DAPI避光孵育2 min，PBS清洗3次，每次2 min; 吸走液體， 加入抗熒光淬滅劑(1∶500 稀釋)，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 MTT法測定星形膠質(zhì)細胞生長曲線 純化培養(yǎng)后，選取單層生長的細胞制成細胞懸液; 培養(yǎng)液稀釋細胞濃度至5×104細胞/mL， 以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板中， 設(shè)1～8 d共8組，每組5個復(fù)孔， 空白調(diào)零組為不接種細胞只加培養(yǎng)液; 于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d后， 小心吸去培養(yǎng)液， 每孔加入培養(yǎng)液180 μL 和MTT 20 μL; 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃下溶解15 min，選擇波長490 nm，以空白組調(diào)零，在酶標儀上測定各孔吸光度(A)值。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察

原代分離的未貼壁細胞呈圓形， 折光性較強。接種10 min就可見少量細胞開始貼壁，30 min后雜細胞已經(jīng)貼壁，而大部分星形膠質(zhì)細胞還處于懸浮狀態(tài)，此時將培養(yǎng)液小心轉(zhuǎn)移至經(jīng)右旋多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)瓶中，8 h后大部分細胞已貼壁;培養(yǎng)至3 d，細胞表面開始長出突起; 培養(yǎng)至8 d，細胞數(shù)量明顯增多，胞體變得膨大，少數(shù)呈現(xiàn)扁平狀，細胞突起更加明顯，呈放射狀分布于胞體周圍; 培養(yǎng)13 d，細胞長滿培養(yǎng)瓶(圖1)，可見細胞基本分為兩層， 下層細胞是星形膠質(zhì)細胞，細胞折光性較弱，胞體呈暗色，突起更加明顯且交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu); 上層分布著少量突起較少、胞體較小的細胞，可能是少突膠質(zhì)細胞，另外也存在極少數(shù)折光性較強，胞體小而明亮，具有兩條長突起，呈串珠狀生長的細胞，可能是神經(jīng)元。經(jīng)多次純化及傳代培養(yǎng)后，神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞明顯減少，此時的星形膠質(zhì)細胞多為不規(guī)則的細胞形態(tài)(圖2)。

2.2 細胞免疫熒光染色

GFAP是星形膠質(zhì)細胞的特異性標志蛋白，定位于胞質(zhì)中的骨架蛋白，常用于星形膠質(zhì)細胞鑒定。我們對分離培養(yǎng)的細胞進行GFAP免疫熒光染色，結(jié)果顯示GFAP陽性細胞激發(fā)紅色熒光，細胞核為藍色。未經(jīng)純化傳代的細胞中存在少量GFAP陰性的雜細胞，此時的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)以多突起為主，還有少量為多角狀及形態(tài)不規(guī)則。經(jīng)過3次純化后，獲得的星形膠質(zhì)細胞純度達到95%，此時的星形膠質(zhì)細胞主要以多角狀和不規(guī)則狀為主，長突起細胞則明顯減少(圖3)。

2.3 樹鼩星形膠質(zhì)細胞生長曲線

生長曲線結(jié)果顯示，在培養(yǎng)1 d、2 d細胞增殖相對較慢，而在3 d、4 d增殖最快，5 d時細胞增殖達到頂峰，且在顯微鏡下觀察到細胞已長滿培養(yǎng)板底部。此后，細胞增殖變緩，細胞數(shù)量逐漸減少。根據(jù)每日測得的A490，取平均值作生長曲線(圖4)。因此，可以選擇傳代培養(yǎng)3 d、4 d的星形膠質(zhì)細胞開展實驗，此時細胞處于對數(shù)生長期，細胞活力最強。

圖1 原代培養(yǎng)的樹鼩脊髓星形膠質(zhì)細胞Figure 1 Morphology of primary cultured astorcytes derived from tree shrew spinal

圖2 經(jīng)三次純化培養(yǎng)后的樹鼩脊髓星形膠質(zhì)細胞Figure 2 Spine astrocytes morphology after three times purification and culture

圖3 GFAP免疫熒光染色結(jié)果Figure 3 Results of immunofluorescence staining of GFAP

圖4 MTT法測定的星形膠質(zhì)細胞生長曲線Figure 4 The growth curve of astrocytes[dx4] by MTT method

3 討論

樹鼩作為與靈長類動物相近的動物， 已被用于很多感染性模型研究中， 包括乙型肝炎病毒[14，15]、丙型肝炎病毒[16，17]、單純皰疹病毒[18，19]、流感病毒[20]、腸道病毒[21-23]。實驗室早期研究[21]表明，樹鼩感染EV71后，部分樹鼩出現(xiàn)了急性松弛性癱瘓， 并有尿潴留癥狀， 組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)在腦部伴隨有相應(yīng)的病理變化，我們推測EV71病毒可能透過血-脊髓屏障，對運動神經(jīng)元造成損傷，出現(xiàn)急性遲緩性麻痹。而星形膠質(zhì)細胞是血-脊髓屏障的重要組成部分，因此，分離樹鼩脊髓星形膠質(zhì)細胞對研究EV71致樹鼩急性遲緩性麻痹具有現(xiàn)實意義。此外，來源于其他物種的星形膠質(zhì)細胞已被用于癲癇、阿爾茨海默癥、柯薩奇病毒感染[24]、EV71感染[25]、流感病毒感染[26]、HCMV感染[27]研究中，而樹鼩來源的脊髓星形膠質(zhì)細胞或許能夠更好地闡明這些疾病和病毒感染的機制。

目前，星形膠質(zhì)細胞的體外分離培養(yǎng)主要來源于動物的腦組織，而鮮有脊髓來源的星形膠質(zhì)細胞分離培養(yǎng)的文獻報道。常用的星形膠質(zhì)細胞體外分離培養(yǎng)方法主要為胰蛋白酶消化法，結(jié)合差速貼壁和恒溫搖床振蕩，以分離得到一定純度的細胞。體外分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中的成纖維細胞是主要的污染細胞[28]，此外，還有少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞的污染。

我們參考國內(nèi)外已有的星形膠質(zhì)細胞體外分離培養(yǎng)方法[10，29-30]，并加以改進。首先，選用新生1～2 d樹鼩作為實驗材料。由于星形膠質(zhì)細胞的分裂增殖高峰發(fā)生在動物胚胎晚期及出生后[31，32]，此時脊髓膜還未成熟，容易分離干凈，能夠減少成纖維細胞污染，且脊髓內(nèi)血管未發(fā)育成熟，可以減少血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞的污染。為減少體外分離培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中的成纖維細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞的污染，我們的經(jīng)驗是在解剖獲得脊髓后，于解剖顯微鏡下盡量去除脊髓外膜和大的血管。我們預(yù)實驗表明，相比于使用成年樹鼩(一歲以上)，使用新生1～2 d乳樹鼩進行細胞分離時脊髓外膜更容易去除干凈， 分離獲得的星形膠質(zhì)細胞純度更高， 可傳代次數(shù)更多。其次， 脊髓組織經(jīng)EDTA- 胰蛋白酶與DNaseⅠ聯(lián)合充分消化后，經(jīng)過細胞篩過濾獲得單個細胞，去除大血管段和組織塊; 利用成纖維細胞和小膠質(zhì)細胞貼壁速度明顯快于星形膠質(zhì)細胞的特點， 對原代細胞進行連續(xù)多次差速貼壁處理，可有效降低成纖維細胞和小膠質(zhì)細胞的污染，但同時會損失部分星形膠質(zhì)細胞; 待細胞長滿后通過恒溫搖床振蕩去除貼壁性弱于星形膠質(zhì)細胞的少突膠質(zhì)細胞;連續(xù)3次純化可以去除分裂能力較弱的神經(jīng)元。

我們觀察到，在原代分離獲得的未純化細胞中，形態(tài)主要以星形為主，具有較多的突起，胞體較平滑呈圓形。經(jīng)過純化和傳代培養(yǎng)后，星形細胞逐漸減少，多角狀形態(tài)不規(guī)則的細胞明顯增多，而免疫熒光鑒定結(jié)果也顯示為星形膠質(zhì)細胞，這符合星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)多樣性。

通過此方法獲得的脊髓源性星形膠質(zhì)細胞純度能夠滿足后續(xù)實驗要求。細胞生長曲線實驗結(jié)果提示，在體外培養(yǎng)3 d、4 d細胞快速增值，5 d達頂峰，相比于大鼠來源的星形膠質(zhì)細胞，生長曲線趨勢基本一致，但生長到達平臺期的時間提前了1 d[33]。本文實驗結(jié)果為脊髓星形膠質(zhì)細胞相關(guān)疾病的研究提供了又一體外模型。