香菇種質(zhì)資源遺傳多樣性研究

陳小敏，吳海冰 ，辜運富

(1.四川省綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院食用菌研究所，四川 綿陽 621000；2.四川農(nóng)業(yè)大學資源學院，成都 溫江 611130)

香菇作為世界第2大食用菌，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，被稱為“山珍”和“植物皇后”。我國擁有豐富的香菇菌種資源，人工種植地主要集中在河南、福建、四川等地[1-2]。香菇子實體的表型特征容易受環(huán)境因素的影響而出現(xiàn)不穩(wěn)定，生長環(huán)境不同導致同一菌種在形態(tài)特征上表現(xiàn)出明顯的差異，所以僅靠傳統(tǒng)形態(tài)學特征對香菇進行分類和鑒定存在一定的局限性。分子生物學的迅速發(fā)展，分子水平鑒定方法突破了傳統(tǒng)方法的局限，為學者們從分子水平上研究食用菌差異性和親緣關(guān)系提供了有力的手段。

DNA分子標記技術(shù)不受環(huán)境因子以及基因表達與否的限制，具有較高的多態(tài)性[3]。相較于形態(tài)學特征以及生理生化指標，分子標記技術(shù)因客觀性更強、操作簡便易行、特異性好、準確性高而越發(fā)受到關(guān)注。基于DNA片段的分子標記技術(shù)，能夠準確反映生物體由于遺傳變異所引發(fā)的核苷酸序列的差異性，在食用菌菌株遺傳多樣性研究、菌株鑒定、基因定位、種質(zhì)資源評價等領(lǐng)域發(fā)揮著不可或缺的作用[4]。目前研究食用菌遺傳多樣性，應(yīng)用較廣泛的DNA分子標記技術(shù)主要包括：ITS、AFLP、SRAP、ISSR和RFLP等。

ISSR技術(shù)能較好地揭示和分析不同物種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，廣泛應(yīng)用于研究遺傳多樣性、基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建和種質(zhì)資源鑒定等領(lǐng)域[5]。同樣，ISSR技術(shù)也在廣泛用于研究大型真菌基因組，檢測基因組多個位點的差異性，例如研究香菇、黑木耳、金針菇、茯苓、蘑菇、羊肚菌等食用菌的遺傳多樣性、菌株鑒別[6]。利用ISSR技術(shù)研究不同遺傳背景的野生毛木耳菌株的遺傳差異性，有助于提升毛木耳育種水平，為培育優(yōu)質(zhì)的毛木耳新品種奠定理論依據(jù)[7]。利用ISSR技術(shù)研究中歐兩國蜜環(huán)菌菌株的遺傳多樣性，研究表明地理隔離導致蜜環(huán)菌菌株表現(xiàn)出遺傳差異，在系統(tǒng)發(fā)育樹上位于各自的進化分支[8]。采用ISSR技術(shù)分析不同來源的樺褐孔菌菌株，成功地將21個菌株劃分為6大類群[9]。以香菇為材料，采用ISSR技術(shù)確證了(TGTA)n微衛(wèi)星基序的存在，在后續(xù)研究中結(jié)合ITS序列分析，有效鑒定了香菇生產(chǎn)菌株[10-11]。Zhang等研究17個中國香菇菌株ISSR指紋圖譜，成功鑒定出全部供試菌株[12]。

目前香菇菌種混亂，品質(zhì)穩(wěn)定性較差且存在退化現(xiàn)象，嚴重阻礙了香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此本研究廣泛收集香菇種質(zhì)資源和野生資源，通過ITS和ISSR分子手段評價種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為后續(xù)雜交育種、原生質(zhì)體融合育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試香菇菌株共計75株，引自全國各地，從上海食用菌研究所、華中農(nóng)大菌種實驗中心、福建三明真菌研究所等地引進香菇資源53份。野生資源22份，采自四川石棉、瀘定和冕寧等地，具體信息見表1所示。

表1 供試菌株

1.2 野生資源的分離及引進資源的活化

PDA固體培養(yǎng)基配制：土豆去皮切成小塊，稱取200g，加入適量的水，沸水煮20min，經(jīng)4層紗布過濾，取濾液[13]。往濾液中加無水葡萄糖20g、瓊脂20g煮沸，最后加水補足到1000mL，pH自然。

野生香菇菌株分離：清理子實體表面雜質(zhì)，用75%酒精對表面進行消毒。撕開子實體，用鑷子取黃豆大小菌肉置于PDA斜面培養(yǎng)基中，25℃恒溫避光培養(yǎng)。查看香菇菌絲的生長情況，選取未污染的菌絲進行純化。

1.3 香菇遺傳多樣性研究

1.3.1 香菇菌株DNA提取 利用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工Sangon Biotech)提取供試香菇樣品的DNA。挑取培養(yǎng)基中表面的菌皮，用濾紙吸干菌絲表面水分，用液氮研磨，按照試劑盒給定的步驟依次進行操作。在含EB的1%瓊脂糖凝膠上水平電泳，120 V/cm電泳10min，以DNA MarkerDL 2000作為分子量標準，用凝膠成像儀檢驗DNA條帶，分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度。DNA純度高，無降解，RNA干擾小，可進行后續(xù)實驗，提取出的DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ITS擴增 用通用引物ITS1(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對75株香菇菌株的ITS序列進行擴增[14]。反應(yīng)體系為30μL：2×Taq PCR Master Mix 15μL(TIANGEN)、引物ITS1/ITS4各0.5μL(10μmol.L-1)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)，加ddH2O補齊至30μL。擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃最終延伸1min；10℃終止反應(yīng)[15]。取PCR產(chǎn)物3μL在含EB的1%瓊脂糖凝膠上水平電泳檢測，120V/cm電泳20min，以DNA MarkerDL2000作為分子量標準，自動凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。將其產(chǎn)物交由擎科生物技術(shù)有限公司(成都)完成測序，向NCBI提交供試香菇菌株的ITS序列，獲得基因登錄號。

1.3.3 ISSR擴增 在前期的試驗中，選用引物P1-P49進行ISSR擴增，結(jié)果表明引物P8(5’-GGAGGAGGAGGAGGA-3’)擴增效果最佳，譜帶穩(wěn)定、清晰、多態(tài)性豐富。反應(yīng)體系為20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL(TIANGEN)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)、引物P82μL(10μmol.L-1)，ddH2O補齊至20μL。擴增程序：94℃預變性2min；94℃變性1min，52℃復性1min，65℃延伸8min，30個循環(huán)；65℃最終延伸16min；4℃終止反應(yīng)[15]。取PCR產(chǎn)物8μL在含EB的2%瓊脂糖凝膠上水平電泳檢測，80V/cm電泳1.5h，以DNA MarkerDL2000作為分子量標準，自動凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。根據(jù)ISSR擴增出的譜帶圖，將同一位置條帶出現(xiàn)與否記為1、0，構(gòu)建數(shù)字化矩陣，用軟件NTSYSpc2.1進行遺傳聚類分析[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用Excel進行平均值和標準值計算，SPSS進行方差、顯著性和相關(guān)性分析。利用NTSYSpc2.1構(gòu)建基于ISSR分析的聚類圖譜。用DNAMAN分析香菇供試菌株間的相似性，在Genbank中下載相似度較高的序列，利用MEGA5的Neighbor-Joining tree程序構(gòu)建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR聚類分析

對供試香菇菌株進行ISSR-PCR擴增，篩選得到引物P8，擴增出的條帶清晰，多態(tài)性及穩(wěn)定性較高，樣品間重復性較好。供試香菇ISSR-PCR擴增出的條帶大小在2000 bp-100 bp之間，供試菌株間擴增出的條帶表現(xiàn)出明顯的差異性，表明不同香菇菌株間存在明顯的遺傳差異性。根據(jù)ISSR擴增出的條帶進行聚類分析，得到香菇菌株間的聚類圖譜(圖1)。

圖1 供試菌株的ISSR聚類分析

從圖中可以看出，供試的75株香菇菌株總體相似性為62%，具有明顯的遺傳多樣性。遺傳相似系數(shù)小于0.62時，所有的供試菌株都聚為一類。在0.74的水平上，供試菌株大致分為6類，其中菌株11、63、73單獨聚為一類，菌株56、39、63、72和37聚為一類，菌株69、26、18、2、16、31、7和5聚為一類，其余的香菇菌株聚在一類。

2.2 供試菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

對供試75株菌株進行ITS-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后檢測得到單一條帶(圖2所示)，對PCR產(chǎn)物進行測序。供試菌株的ITS序列片段長度大約為750bp，將測序得到的75個香菇菌株的ITS序列進行Blast(NCBI數(shù)據(jù)庫)比對，比對結(jié)果顯示供試菌株均與香菇菌株的相識度較高，這表明供試菌株均為香菇菌株。

圖2 供試菌株ITS-PCR擴增條帶

選擇匹配度最高的香菇參比菌株，并提交至NCBI，并獲得了基因登錄號。以糙皮側(cè)耳平菇(Pleurotusostreatus)和金針菇(Flammulinavelutiper)為外類群，對75個供試香菇菌株和5個GenBank參比序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3所示)。如圖3所示，供試香菇菌株與4株香菇參比菌株聚在一起，而與外類群平菇明顯分開。供試菌株大致可以分為5大類群，其中57、60、68、67、69、72、66和63聚為一類，54聚為一類，55聚為一類，61、73、62、64、65、58、71和56聚為一類，其余菌株聚為一類。其中57和60相識度為99%，說明這兩個菌株的親緣關(guān)系較近。

圖3 供試菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

分子生物學的發(fā)展，推動了分子標記技術(shù)在食用菌遺傳多樣性上的研究，學者們采用DNA序列分析研究食用菌的系統(tǒng)發(fā)育學，自1994年ISSR分子標記技術(shù)提出以來，廣泛用于評價靈芝、香菇等食用菌遺傳多樣性[17-18]和菌株的鑒定鑒別[19]。不同的香菇菌株的DNA序列存在差異，在ISSR-PCR擴增時不同香菇菌株DNA序列與引物P8結(jié)合，擴增出獨特的ISSR條帶，因此ISSR分子標記技術(shù)能反應(yīng)出供試香菇菌株間的遺傳多樣性。在本試驗中，供試香菇菌株的ISSR電泳圖譜具有明顯的差異性，聚類分析顯示出相似系數(shù)小于0.62時，供試75株香菇菌株聚為一類，在相似系數(shù)為0.74時，供試菌株聚類6大類群，說明供試75株香菇菌株間表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。

基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹是目前研究靈芝、香菇等食用菌種間、種內(nèi)水平差異的主要分子手段。本研究中基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將供試75株香菇菌株分為5大類群，其中菌株57(LDT11-77)和60(LDT2011.2)相似度99%，且這兩個野生菌株均采集同一地區(qū)，則野生菌株LDT11-77和LDT2011.2疑是同種異名菌株。從系統(tǒng)發(fā)育樹中可以看出，引進資源聚在一個類群，明顯的與野生資源分開，這可能是四川野生資源與引進資源存在地理隔離，從而引起遺傳差異。前人通過ITS測序研究中國香菇種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果表明西南地區(qū)野生香菇資源遺傳多樣性最為豐富。從本研究系統(tǒng)發(fā)育樹上看，采自于四川的野生野生資源分屬于不同的類群，說明四川野生香菇資源具有豐富的遺傳多樣性。