鼠李糖乳桿菌發酵提取物在護膚乳液中的抑菌性研究

周龍梅

（山東利爾康醫療科技股份有限公司上海研發中心，上海 201203）

防腐劑在日化產品中的主要功能是抑制細菌繁殖，以防止產品變質或產生毒素，同時防腐劑還有助于產品穩定和產品存儲。在公眾消費者的壓力下，全球各個國家對禁用和限用的日化原料成分的管制更加嚴格，允許使用的防腐劑將越來越少。

許多學者研究了乳酸桿菌在發酵過程中產生的具有抑菌性能的物質，該物質可用于食品防腐劑[1,2]。Chun Chia Chen[3]等從植物乳桿菌發酵液中提取出的抗菌物質能抑制變種鏈球菌。A.R.Sarika[4]等從鼠李糖乳桿菌發酵液中提取出了具有抗菌活性的物質，Sigrid C.J.De Keersmaecker[5]等研究了從鼠李糖乳桿菌發酵液中提取的抗菌物質能抑制鼠傷寒沙門氏桿菌。本研究參考文獻[6,7]從鼠李糖乳桿菌發酵液中提取出抗菌活性物，該物質經實驗驗證對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌具有抑菌性能。將此抗菌物質添加至護膚乳液中能有效抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌繁殖。該抗菌物質添加到護膚品中，能抑制細菌繁殖，從而可延長產品貨架期，可以作為日用護膚品中合成防腐劑的替代品。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大腸埃希菌（Escherichia coli ATCC 8739）；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027）；白色念珠菌（Candida albicans （ATCC 10231）；以上菌種由中國普通微生物菌種保藏中心提供。

營養培養基、營養瓊脂培養基、沙氏培養基、沙氏瓊脂培養基，稀釋液（質量分數為0.85%滅菌生理鹽水）。

FM200弗魯克均質攪拌器，上海弗魯克科技發展有限公司； HJ-3磁力加熱攪拌器，常州崢嶸儀器有限公司。

1.2 鼠李糖乳桿菌發酵液提取物制備

參照文獻[6,7]。鼠李糖乳桿菌在特定培養基中進行28 h靜置發酵培養，發酵液在75 ℃水浴中加熱1 h以滅活發酵液中的酶，發酵液冷卻后用質量分數20%的氫氧化鈉溶液調節酸堿度為6.5左右攪拌1 h，在5 ℃、7 500 r·min-1離心10 min，去除上清液收集沉淀，以去除發酵液中的過氧化氫、酶等物質，沉淀用質量分數0.85%的滅菌生理鹽水懸浮洗滌2次，每次0.5 h，懸浮液在5 ℃、7 500 r·min-1離心10 min，去除上清液收集沉淀，進一步去除過氧化氫、酶等物質，2次洗滌后的沉淀用質量分數2.0%乳酸溶液進行攪拌懸浮1 h，乳酸溶液用量為鼠李糖乳桿菌發酵液的1/30，懸浮液在5 ℃、7 500 r·min-1離心10 min，收集上清液去除沉淀，上清液再經0.2 μm的微孔膜進行過濾得鼠李糖乳桿菌發酵液提取物。

質量分數2.0%乳酸溶液的配制：在滅菌后的特定培養基溶液中加入氯化鈉至質量分數為0.85%，然后加入乳酸至乳酸質量分數為2.0%，鹽酸調節pH為4.36，經過0.2 μm的微孔膜過濾得到含質量分數為2.0%乳酸溶液。

采用凱氏定氮法[8]測定發酵提取物中蛋白質質量分數。

1.3 抑菌圈實驗

抑菌圈實驗方法參考2002年版《消毒技術規范》。

將指示菌細菌在液體營養培養基中活化，35 ℃新鮮培養20 h，取菌懸液1 mL至9 mL稀釋液中進行稀釋，稀釋至一定濃度（約108CFU·mL-1）；指示菌白色念珠菌在沙氏液體培養基中活化，35 ℃新鮮培養20 h，取菌懸液1 mL至9 mL稀釋液中，稀釋至一定濃度（約106CFU ·mL-1）。

先將6 mL固體培養基平鋪于平板中，置于水平臺面上靜置凝固，分別取1 mL稀釋至約108CFU·mL-1細菌或106CFU ·mL-1白色念珠菌的新鮮培養指示菌與10 mL融化并溫熱的固體培養基（細菌為營養瓊脂培養基，白色念珠菌為沙氏瓊脂培養基）混勻，傾倒于平板中。將平板打開蓋使無菌空氣流通約0.5 h以利于細菌素擴散。將牛津杯輕輕放置于平板上，將200 μL鼠李糖乳桿菌發酵液提取物樣品加入牛津杯后于4 ℃冰箱中擴散5 h，然后35 ℃培養24 h觀察抑菌圈。

1.4 護膚乳液樣品的配制

配方組成：I相：乳化劑（硬脂酸甘油酯、PEG-100硬脂酸酯），質量分數3.0%；硬脂醇，質量分數0.5%；異壬酸異壬酯，質量分數3.0%；二辛基醚，質量分數3.0%；生育酚乙酸酯，質量分數0.5%。黃原膠，質量分數0.3%；質量分數為10%檸檬酸溶液，適量；1,3-丁二醇，質量分數5.0%；水加至質量分數100%。

將I相混合加熱至75 ℃，同時將水和1,3-丁二醇混合加熱至75 ℃，然后將I相加入到水和1,3-丁二醇混合物中3 000 r·min-1均質20 min，冷卻至40 ℃加入黃原膠，3 000 r·min-1均質2 min后加入質量分數為5%鼠李糖乳桿菌發酵提取物，再用檸檬酸溶液調節pH得護膚乳液樣品。

以不添加鼠李糖乳桿菌發酵提取物、10%檸檬酸溶液調節pH為5.0的護膚乳液作為對比樣。

1.5 抑菌實驗

抑菌實驗方法參考美國藥典USP＜51＞ Antimicrobial effectiveness testing。

將1 mL培養好的指示菌液至9 mL稀釋液中進行稀釋，將指示菌稀釋為1×108CFU·mL-1～1×109CFU·mL-1的菌懸液，確定細菌數。

將含鼠李糖乳桿菌發酵提取物的護膚乳液調節pH為5.0、6.0、7.0進行挑戰測試，評估其抑菌性能。將大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌接種至含有鼠李糖乳桿菌發酵提取物乳液樣品中培養28天，在此期間定期測試樣品中存活微生物。

分別稱取pH為5.0、6.0及7.0含有鼠李糖乳桿菌發酵提取物待測乳液樣品100 g，分別倒入9個帶蓋容器中；稱取對比樣品100 g，分別倒入3個帶蓋的容器中；分別標記大、金、綠、pH及日期。

分別在9個容器中對應加入1 mL 1×108CFU ·mL-1～1×109CFU ·mL-1的細菌菌懸液，混勻后蓋上蓋子；在對比樣品中對應加入1 mL 1×108CFU ·mL-1～1×109CFU ·mL-1的細菌菌懸液，混勻后蓋上蓋子，置于（32.5±2.5）℃的培養箱中培養。

分別在7天、14天、28天分別計算樣品中活的細菌。每次計算完細菌總數后將平皿放回培養箱，以待下次觀察用，觀察中切勿打開平皿，以免染菌而使下次無法觀察。

2 結果與討論

2.1 發酵提取物中蛋白質含量及酸堿度測定

采用凱氏定氮法測定鼠李糖乳桿菌發酵提取物中蛋白質含量，由測定結果可知，鼠李糖乳桿菌發酵提取物中蛋白質質量分數為0.246 4%；按照2002年版《消毒技術規范》中pH測定方法測定發酵提取物pH為4.36。

2.2 鼠李糖乳桿菌發酵提取物抑菌圈實驗

圖1為鼠李糖乳桿菌發酵提取物對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的抑菌圈實驗，圖中1表示鼠李糖乳桿菌發酵提取液抑菌圈，2表示質量分數為2.0%乳酸溶液抑菌圈。經測定鼠李糖乳桿菌發酵提取液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌抑菌圈直徑分別為19、23和24 mm，鼠李糖乳桿菌發酵提取物中的蛋白質具有一定的抑菌性；質量分數為2.0%乳酸溶液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌均無抑菌圈；發酵提取液和乳酸溶液對白色念珠菌均無抑菌圈。

圖1 抑菌圈實驗Fig.1 Inhibition zone test

2.3 含鼠李糖乳桿菌發酵提取物乳液抑菌實驗

2.3.1 對大腸埃希菌抑菌實驗

圖2為乳液對大腸埃希菌的抑菌實驗。從圖2中可以看出，對比樣品在第14天及28天大腸埃希菌數量略有增加，說明對比樣品對大腸埃希菌沒有抑菌作用。pH為5.0、6.0及7.0的含有鼠李糖乳桿菌發酵提取物的乳液在第7天對大腸埃希菌的抑菌率都能達到99.9%，14天、28天活菌數持續減少，抑菌率持續增大；從圖中還可以看出，pH影響鼠李糖發酵提取物對大腸埃希菌的抑菌性能，pH為5.0時對大腸埃希菌的抑菌性能最好。

圖2 乳液對大腸埃細菌的抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of the lotion to Escherichia coli

2.3.2 對金黃色葡萄球菌抑菌實驗

圖3為乳液對金黃色葡萄球菌的抑菌實驗。從圖3中可以看出，對比樣品在第28天金黃色葡萄球菌數量略有增加，說明對比樣品對金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用。pH 為5.0、6.0及7.0的含鼠李糖乳桿菌發酵提取物的乳液在第7天對金黃色葡萄球菌的抑菌率都能達到99.9%， 14天活菌數持續減少，28天pH6.0及pH7.0抑菌率持續增大，在28天pH5.0活菌數略有增加。

圖3 乳液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用Fig.3 Antibacterial effect of the lotion to Staphylococcus aureus

2.3.3 對銅綠假單胞菌抑菌實驗

圖4為乳液對銅綠假單胞菌的抑菌實驗。從圖4中可以看出，對比樣品在第28天銅綠假單胞菌數量幾乎不變，說明對比樣品對金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用。pH為5.0、6.0及7.0的含有鼠李糖乳桿菌發酵提取物的乳液在第7天對銅綠假單胞菌抑菌率都能達到99.9%， 14天、28天活菌數持續減少，抑菌率持續增大；從圖中還可以看出， pH為5.0和 6.0時其抑菌性能相差不大。

圖4 乳液對銅綠假單胞菌的抑菌作用Fig.4 Antibacterial effect of the lotion to Pseudomonas aeruginosa

3 結論

鼠李糖乳桿菌發酵提取物含有一定量的蛋白質，該蛋白質對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌具有顯著地抑制作用，對白色念珠菌沒有抑制作用。添加質量分數為5%的鼠李糖乳桿菌發酵提取液于護膚乳液中，能有效抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌。