錯配修復蛋白和Ki-67在結直腸癌中的表達及其臨床意義

馬春濤 許春芳 張海玲

蘇州市相城人民醫院消化內科1(215131) 蘇州大學附屬第一醫院消化內科2 宿遷市第一人民醫院消化內科3

背景：結直腸癌(CRC)是常見的癌癥之一，是具有多種生物學發病機制的異質性疾病實體。目的：探討錯配修復蛋白(MMRP)和Ki-67蛋白在CRC中的表達，分析微衛星不穩定性(MSI)、Ki-67與CRC臨床病理特征的關系。方法：回顧性分析2014年1月—2016年12月蘇州大學附屬第一醫院收治的90例CRC患者的臨床病理資料，采用免疫組化法檢測4種MMRP(MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)和Ki-67蛋白表達，并分析MSI、Ki-67與CRC患者臨床病理特征的關系以及MSI與Ki-67表達的相關性。結果：MMRP表達缺失率為16.7%，其中MLH1、PMS2、MSH2和MSH6的表達缺失率分別為11.1%、11.1%、6.7%、4.4%。Ki-67陽性率為90.0%。MSI與腫瘤部位有關(P<0.05)，Ki-67表達與腫瘤部位和大體類型有關(P<0.05)。MSI與Ki-67表達無關(P>0.05)，MLH1與PMS2表達呈正相關(r=0.577，P<0.05)，MSH2表達與MSH6表達呈正相關(r=0.739，P<0.05)。結論：CRC中MLH1、PMS2表達缺失較MSH2和MSH6多見。MSI與腫瘤部位相關，Ki-67與腫瘤部位和大體類型有關，對CRC的診療和預后具有一定的指導意義。但MSI與Ki-67表達無關，兩者聯合檢測并不能提高診斷CRC的準確性。

結直腸癌(CRC)是嚴重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，在世界范圍內發病率居惡性腫瘤第三位，據估計全球每年約有140萬CRC新發病例[1]。近年我國CRC的發病率呈明顯上升趨勢，死亡率居所有癌癥的第五位。CRC可能由結腸黏膜細胞大量癌基因、抑癌基因、錯配修復基因以及細胞周期調節基因的表觀遺傳學和基因改變而導致[2]，其主要的致病途徑包括染色體不穩定性(CIN)、微衛星不穩定性(MSI)和CpG島甲基化(CIMP)，表觀遺傳學改變包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA的改變[3]。

MSI是由錯配修復蛋白(MMRP)(包括MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)失活導致基因突變而產生[4]。MMRP是一種核酶，參與修復增殖細胞DNA復制產生的錯配堿基，其缺失將導致DNA錯配積聚，導致MSI[5-6]。MMRP與細胞生長、分化、凋亡有關的基因突變有關，若在DNA合成過程中丟失保真度將影響CRC的發生、發展[7]。

Ki-67是一個反映細胞增殖狀態的指標，在靜止的細胞中無表達，在細胞周期M期、G1后期、G2期和S期均有表達，與細胞增殖活性以及腫瘤的發生、發展和轉移有關[8]。

本研究通過探討MMRP、Ki-67在CRC中的表達及其與臨床病理的關系，并分析MMRP與Ki-67的相關性，旨在分析MSI、Ki-67與腫瘤發生、發展之間的關系。

對象與方法

一、資料來源

收集2014年1月—2016年12月至蘇州大學附屬第一人民醫院行手術治療的CRC切除標本90例，其中男性57例，女性33例，男女之比為1.73∶1；年齡28～86歲，平均(62.5±2.1)歲。排除標準：家族性腺瘤性息肉病；非原發性CRC；放化療后復發性CRC；術后病理檢查證實為非結直腸癌。所有病例均具有完整的臨床信息，且患者術前均未接受過放化療。

二、研究方法

所有患者的標本經4%甲醛溶液固定，石蠟包埋后存檔。應用免疫組化法檢測腫瘤組織中MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和Ki-67表達，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。鼠抗人單克隆抗體MLH1(工作濃度1∶500)、鼠抗人單克隆抗體PMS2(工作濃度1∶500)、鼠抗人單克隆抗體MSH2(工作濃度1∶500)、鼠抗人單克隆抗體MSH6(工作濃度1∶500)和即用型鼠抗人單克隆抗體Ki-67均購自羅氏公司。

結果判斷：MLH1、PMS2、MSH2、MSH6均定位于細胞核，呈黃色或棕黃色顆粒為陽性表達，腫瘤細胞核不著色判定為缺失。MLH1、PMS2、MSH2、MSH6蛋白中任意一種缺失判定為MSI，四種蛋白均表達為微衛星穩定(MSS)。Ki-67定位于細胞核，呈棕黃色顆粒為陽性細胞，按陽性細胞比例數分為：(-)，≤10%；(+)，11%～25%；(++)，25%～50%；(+++)，≥50%，(-)歸為Ki-67陰性表達組，(+)、(++)、(+++)歸為陽性表達組。每例標本均經兩位資深病理醫師復診。

三、統計學分析

應用GraphPad Prism 6統計軟件，計數資料的比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、MMRP、Ki-67在CRC中的表達

90例CRC中MMRP陽性者75例(83.3%)，表達缺失者15例(16.7%)，其中MLH1、PMS2、MSH2、MSH6表達缺失者分別為10例(11.1%)、10例(11.1%)、6例(6.7%)和4例(4.4%)，MLH1和PMS2共同表達缺失者9例(10.0%)，MSH2和MSH6共同表達缺失者4例(4.4%)，4種蛋白表達均缺失者1例(1.1%)。Ki-67陰性表達者9例(10.0%)，陽性表達者81例(90.0%)(圖1)。

二、MSI、Ki-67表達與CRC臨床病理特征的關系

A：Ki-67(×100)；B：MLH1(×400)；C：PMS2(×400)；D：MSH2(×400)；E：MSH6(×400)

MSI與腫瘤部位有關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、大體分型、組織學類型、分化程度、腫瘤分期、淋巴結轉移、浸潤程度、遠處轉移、脈管浸潤等均無關(P>0.05)(表1)。

Ki-67表達與腫瘤部位、大體分型有關(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織學類型、分化程度、腫瘤分期、淋巴結轉移、浸潤程度、遠處轉移、脈管浸潤等均無關(P>0.05)(表1)。

三、MSI與Ki-67的相關性分析

MSI與Ki-67表達無相關性(r=-0.149，P=0.161)，MLH1表達與PMS2表達呈正相關(r=0.577，P<0.05)，MSH2表達與MSH6表達呈正相關(r=0.739，P<0.05)。

表1 MSI和Ki-67表達與CRC患者臨床病理特征的關系(n)

討 論

CRC的發生、發展是一個受多基因、多步驟調控的復雜過程，約15%的CRC伴有DNA錯配修復缺陷和高水平MSI[9]。MSI可能對CRC的預后評估和治療分層具有一定的指導意義。

本研究顯示，MLH1-PMS2、MSH2-MSH6的共同缺失率分別為10.0%、4.4%，且MLH1與PMS2、MSH2與MSH6均呈正相關(r=0.577，r=0.739)，提示MLH1與PMS2、MSH2與MSH6常協同表達或缺失，這可能與DNA在損傷修復過程中MLH1和MSH2分別與其同源性MMRP形成復合體發揮作用機制相關。國外研究顯示，MMRP缺失的CRC患者可伴有一系列臨床病理特征，如腫瘤常見于結腸近端、腫瘤分期為Ⅱ期、分化差以及黏液腺癌[10-11]。本研究顯示，腫瘤位于右半結腸者的MMRP表達缺失率更高，但MSI與性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤分化、病理分型、淋巴結轉移等臨床病理特征無相關性。

Ki-67是應用最廣泛的判斷腫瘤細胞增殖活性的指標之一，與腫瘤的發生和發展相關。Ki-67表達與CRC臨床病理特征之間的關系目前尚無定論。Forones等[12]的研究表明Ki-67與CRC臨床病理指標無關，評估患者預后的價值有限。Sen等[13]認為Ki-67表達與CRC分化程度、分期有關，腫瘤細胞分化程度越低、伴有淋巴結轉移者的Ki-67表達水平越高。本研究中，CRC患者的Ki-67陽性率為90.0%，且與腫瘤部位、大體分型有關，即在左半結腸腫瘤、潰瘍型和隆起型的腫瘤中具有較高的表達，提示Ki-67在CRC的增生程度、預后評估中均有一定的意義。關于Ki-67在CRC中研究結果的不同可能是由于樣本數量、地域種族、非標準化操作等所致。

本研究還發現，MSI與Ki-67表達無相關性(P>0.05)，提示MMRP和Ki-67聯合檢測可能并不能提高對CRC診療和預后評估的準確性。但通過檢測MMRP和Ki-67可更好地了解我國CRC的特點，對CRC的早期診斷、風險評估、預后評估具有一定的參考意義，需要今后增大樣本量并行隨訪來進一步證實。