原發(fā)性膽汁性膽管炎患者維生素D受體表達降低對免疫反應影響的研究

肖 輝 胡 鋒 蘭 亞

商洛市中心醫(yī)院消化內科(726000)

背景：免疫作用在原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)的發(fā)生中起有關鍵作用，維生素D通過維生素D受體(VDR)發(fā)揮免疫調節(jié)作用，可能參與PBC的發(fā)生和發(fā)展。目的：探討PBC患者VDR表達降低對免疫反應的影響。方法：選取30例PBC患者，以30例非PBC患者作為對照。以實時定量PCR法檢測肝臟組織和外周血單個核細胞(PBMC)中VDR、SOCS-1、miR-155 mRNA表達，蛋白質印跡法和免疫組化法檢測VDR、SOCS-1蛋白表達。比較對照組和PBC患者肝臟組織以及PBMC中VDR、SOCS-1和miR-155表達情況，并分析PBC患者肝臟組織VDR、SOCS-1和miR-155表達的相關性。結果：與對照組相比，PBC患者肝臟組織VDR、SOCS-1 mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)，miR-155 mRNA表達顯著升高(P<0.05)；PBMC中VDR、SOCS-1 mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。PBC患者肝臟組織VDR蛋白與SOCS-1表達水平呈正相關，miR-155表達與VDR、SOCS-1表達水平均呈負相關。結論：PBC患者VDR表達顯著降低，其可能通過miR-155和SOCS-1參與PBC發(fā)生、發(fā)展的調控。

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholan-gitis, PBC)的特點是免疫介導的肝內膽小管和門靜脈的炎癥破壞，可進一步導致肝纖維化和肝衰竭。目前，PBC的發(fā)病機制尚未完全清楚，其中免疫反應起有關鍵作用[1]。維生素D具有免疫調節(jié)作用，可通過維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)發(fā)揮作用。本研究通過探討PBC患者體內VDR表達情況，旨在分析其對PBC患者免疫反應的影響。

對象與方法

一、一般資料

選取2017年1月—2017年12月商洛市中心醫(yī)院收治的 30例PBC患者，診斷符合美國肝病學會2000年推薦的PBC診斷指南[2]。選取同期30例肝組織活檢示非PBC患者作為對照組。本研究方案由商洛市中心醫(yī)院倫理委員會審批通過，取得所有患者及其家屬知情同意。

二、研究方法

1. 實時定量PCR檢測組織中VDR、SOCS-1和miR-155 mRNA表達：抽提肝組織總RNA，逆轉錄合成cDNA(試劑盒購自上海根生生物科技有限公司)。PCR引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。VDR引物上游：5’-CTG GTG ACT TTG ACC GGA AT-3’，下游：5’-CTG CAG CTC CTC ATC TGT GA-3’；SOCS-1引物上游：5’-CAC GCA CTT CCG CAC ATT CC-3’，下游：5’-TCC AGC AGC TCG AAG AAA GCA-3’；miR-155引物上游：5’-AGT GCG TGT CGT GGA GTC-3’，下游：5’-GGG GTT AAT GCT AAT TGT GA-3’；GAPDH引物上游：5’-CCT TCA TTG ACC TCC ACT AC-3’，下游：5’-GTT GTC ATA CTT CTC ATG GTT C-3’。PCR反應條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，循環(huán)共40次。作熔解曲線驗證擴增產物的特異性。采用2-△△Ct法計算靶基因mRNA相對表達水平。

2. 蛋白質印跡法檢測VDR、SOCS-1蛋白表達：提取各組總蛋白，分別加入VDR抗體(工作濃度1∶1 000，Santa Cruz公司)、SOCS-1抗體(工作濃度1∶1 000，Santa Cruz公司)、GAPDH抗體(工作濃度1∶2 000，Santa Cruz公司)4 ℃孵育過夜，加入羊抗鼠IgG(工作濃度1∶2 500，Santa Cruz公司)作為二抗，室溫孵育。以ECL化學發(fā)光法定量檢測蛋白表達。

3. 免疫組化法：肝組織常規(guī)石蠟包埋，脫蠟水化，抗原修復，H2O2室溫阻斷內源性過氧化物酶，室溫封閉，加入VDR抗體作為一抗(以1∶200稀釋，Santa Cruz公司)孵育過夜，PBS洗滌，加入IgG(以1∶200 稀釋，Santa Cruz公司)作為二抗室溫孵育，PBS洗滌，DAB顯色、蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。

結果判定：細胞核和(或)細胞質中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒計為陽性細胞。計數(shù)陽性細胞占總細胞的比例，陽性細胞數(shù)<5%為(-)，5%～25%為(+)，26%～50%為(++)，>50%為(+++)。

4. 外周血單個核細胞(PBMC)分離和表達的檢測：取患者靜脈血15 mL，按密度梯度離心法分離單個核細胞。采用實時定量PCR法檢測PBMC中VDR、SOCS-1和miR-155 mRNA表達，蛋白質印跡法檢測VDR、SOCS-1蛋白表達。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、患者的一般情況

PBC患者與對照組的性別、年齡、1,25-(OH)2維生素D濃度相比差異均無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較

二、肝臟組織VDR表達情況比較

PBC患者肝臟組織VDR mRNA和蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)(圖1、表2)。

1 Da=0.992 1 u

表2 兩組患者肝臟組織VDR表達情況比較

VDR陽性表達于細胞核和細胞質(圖2)，PBC患者肝臟組織VDR蛋白表達陽性率顯著低于對照組(16.7%對86.7%)(χ2=9.520，P=0.000)。

A：VDR陽性表達；B：VDR陰性表達

三、肝臟組織SOCS-1和miR-155表達情況比較

PBC患者肝臟組織SOCS-1 mRNA和蛋白表達均顯著低于對照組，miR-155 mRNA表達顯著升高(P<0.05)(圖3、表3)。

圖3 兩組患者肝臟組織SOCS-1蛋白表達(蛋白質印跡法)

表3 對照組和PBC患者肝臟組織SOCS-1和miR-155表達情況比較

四、PBMC中VDR、SOCS-1和miR-155表達情況比較

PBC患者PBMC中VDR、SOCS-1 mRNA和蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)，而兩組miR-155 mRNA表達相比無明顯差異(表4)。

五、PBC患者肝臟組織VDR、SOCS-1和miR-155表達的相關性分析

PBC患者肝臟組織VDR表達與SOCS-1表達呈正相關(r=0.712，P=0.014)，miR-155表達與VDR(r=-0.614，P=0.038)、SOCS-1(r=-0.762，P=0.001)表達均呈負相關。

討 論

PBC中調節(jié)T細胞的免疫抑制功能降低，Th1、Th2和Th17細胞被過度激活，進而引起自身免疫增強和膽管細胞凋亡。研究表明維生素D在預防自身免疫性疾病方面有潛在的作用[3-4]。維生素D是一種免疫調節(jié)劑，通過抑制T細胞的激活和增殖，抑制促炎細胞因子或誘導相關轉錄調節(jié)基因的表達，調節(jié)T細胞分化[5]。維生素D的生物效應是通過VDR介導而實現(xiàn)的，VDR是一種NR1I家族受體，具有轉錄因子活性，可與視網膜X受體形成異質二聚體，并與靶基因DNA應答元件結合，從而發(fā)揮功能。miR-155是一種主要局限于造血細胞的miRNAs，在淋巴細胞活化作用下調控細胞增殖和分化[6]。miR-155通過下調SOCS蛋白的抑制作用來形成細胞因子信號，這些蛋白參與抑制炎癥反應，在免疫平衡中起有至關重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)SOCS-1敲除小鼠由于外周血T細胞過度激活和肝臟壞死，在出生后3周內死亡，而T細胞特異性SOCS-1條件敲除小鼠則發(fā)展為自身免疫性炎性疾病[7]。此外，SOCS-1的多態(tài)性也與PBC有關[8]。

本研究中，PBC患者肝臟組織和PBMC中VDR、SOCS-1 mRNA和蛋白表達均顯著低于對照組(P<0.05)，肝臟組織miR-155 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)。相關性分析發(fā)現(xiàn)PBC患者肝臟組織VDR與SOCS-1表達水平呈正相關，miR-155表達與VDR、SOCS-1表達水平呈負相關。說明PBC中SOCS-1的過度抑制與肝組織miR-155表達上調有關。miR-155由bic基因編碼，具有重要的免疫調節(jié)作用。miR-155在多種免疫細胞中表達較低，可被抗原、Toll樣受體配體或炎性細胞因子刺激[9]。在活化細胞中，miR-155靶向SOCS-1，促進炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展。此外，miR-155可維持Treg細胞的競爭適應性和穩(wěn)態(tài)，F(xiàn)OXP3上調通過miR-155靶向SOCS-1而促進Treg細胞的擴張。在缺乏SOCS-1的情況下，Treg細胞會變成有害的效應T細胞，可能引起嚴重的結腸炎、肝臟退化或淋巴樣缺陷等。miR-155通過靶向SOCS-1蛋白來抑制負反饋調節(jié)而延長炎癥反應[10]。在缺乏VDR的情況下，miR-155上調可能導致抑制SOCS-1負反饋環(huán)的解除，從而引發(fā)持續(xù)的炎癥反應。相關研究發(fā)現(xiàn)維生素D/VDR信號通過靶向miR-155-SOCS-1通路，增加負反饋調節(jié)來減少炎癥。目前，維生素D信號與肝臟疾病的相關研究多集中于基因研究以及VDR多態(tài)性與臨床表現(xiàn)之間的相關性[11-12]。

表4 對照組和PBC組患者PBMC中VDR、SOCS-1和miR-155表達情況比較

本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者VDR表達顯著降低，這為PBC患者的肝組織病理改變提供了新的見解，可能說明了VDR信號與炎癥反應的相關性。本研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者PBMC中VDR mRNA和蛋白表達顯著降低，肝臟組織VDR和SOCS-1表達亦顯著降低。此外，上調的miR-155表達伴有較低的SOCS-1蛋白合成。因此，PBC患者肝臟組織SOCS-1表達減少可能阻礙了炎癥反應的負反饋調節(jié)。25-羥基維生素D缺乏癥不僅是PBC的特點，也是慢性肝病的主要特征。PBC中維生素D水平下降與疾病表現(xiàn)以及其他自身免疫性疾病的共同發(fā)病有關。值得一提的是，本研究PBC患者25-羥基維生素D水平正常，而VDR表達顯著降低，認為VDR不足可能是導致表達翻譯的維生素D誘導信號，進一步引起持續(xù)炎癥反應的關鍵。

總之，PBC患者VDR表達顯著降低，其可能通過miR-155和SOCS-1參與PBC發(fā)生、發(fā)展的調控。