樺褐孔菌黃酮含量測定及抗氧化研究

林雪松，李秀格，崔鑫鑫，靳 微，李 敏*

（吉林農業科技學院中藥學院·吉林吉林·132101）

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)，主要分布在西伯利亞、俄羅斯和遠東地區、波蘭、北歐、中國大、小興安嶺和長白山地區、黑龍江、日本北海道及北美北部等緯度在北緯 45°～50°的寒冷的地區[2]。又名白樺茸等，是一種生長在樺樹上的藥用真菌[1]?，F代研究表明，樺褐孔菌中主要化學成分為三萜類、甾醇類和生物堿類化學成分[3]，具有抗癌、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗真菌等多種生物活性[4～5]。迄今，有關樺褐孔菌的質量研究報道較少。本實驗擬對八個產地的樺褐孔菌進行總黃酮含量測定及抗氧化研究，為樺褐孔菌質量研究提供理論基礎，進一步擴大樺褐孔菌資源的開發，保證其及相應制劑的穩定性。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

樺褐孔菌樣品為實地采集或由相關單位提供，樣品信息如下S1-西藏林芝、S2-黑龍江黑河、S3-黑龍江牡丹江、S4-黑龍江伊春、S5-吉林長白山、S6-吉林吉林、S7-俄羅斯西伯利亞、S8-日本北海道，留樣憑證存放于吉林農業科技學院藥物分析實驗室。

抗壞血酸 （維生素C，南京化學試劑有限公司）；DPPH （1，3-二苯基-2-三硝基苯肼）；KH2PO4；Na2HPO4；蘆丁標準品（吉林生物制品檢驗所）；無水乙醇；甲醇；5%亞硝酸；10%硝酸鋁；0.1mol/L氫氧化鈉 （以上試劑均為分析級）。

CP114電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；G-08A型高速中藥粉碎機 （浙江瑞安市百信藥機器械廠）；TDL-40B離心機 （東旺儀器設備有限公司）；DHG-9035A型電熱鼓風干燥箱（上海源長實驗儀器設備廠）；恒溫水浴鍋 (天津市泰斯特儀器有限公司，DK-98-II）；THC型數控超聲波提取器 （濟寧天華超聲電子儀器有限公司）；UV-2500紫外可見分光光度計 （日本島津公司）；N-1100型旋轉蒸發儀（瑞士布其有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的制備

精密吸取標準蘆丁對照品溶液 (200μg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 分別置于 10 mL 比色管中， 各加60%乙醇至5 mL；加5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min后，加10%A1(NO3)3溶液 0.5mL，搖勻，再放置6min;加4%NaOH溶液4mL，搖勻放置10～20 min。在510 nm波長處，以第1管溶液做空白分別測定吸光度，以吸光度對濃度進行回歸，繪制標準曲線，并計算回歸方程。

1.2.2 總黃酮含量測定

將樺褐孔菌烘干、粉碎，精密稱取50℃干燥至恒重的樺褐孔菌粉末1g，置于三角瓶中，加入50%乙醇100mL，超聲波調至 60℃條件下，超聲 15～20min，過濾，收集濾液，提取兩次，用50%乙醇定容，即得。

精密吸取黃酮提取液1.0mL置于10mL比色管中，按各加60%乙醇至5mL進行操作，加5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置 6min；再加 10%Al(NO3)3溶液 0.5mL，搖勻放置6min；加4%NaOH溶液4mL，搖勻放置10～20 min。在510nm波長處，測定吸光度。X=(A+0.0052）×10×100/(6.03×m×1000）

式中，X為樣品中總黃酮含量(以蘆丁計)%；A為吸光度，m為樣品的質量g。

1.2.3 方法學考察

加樣回收率 精密稱取S1、S2兩份樣品，各3份，分別將對照溶液 1.0、2.0、3.0mL 置于三角瓶中，按“1.2.2”提取及測定。

精密度 精密稱取S3樣品5份平行樣，置于三角瓶中，按“1.2.2”提取及測定。

穩定性 選擇S6樣品進行穩定性實驗，在0、15、30、45、60 min 測定其吸光度。

1.2.4 黃酮抗氧化能力測定

羥基自由基(－OH)的測定：向試管中加入1.00mL蒸餾水，FeSO4溶液2.00mL，水楊酸-乙醇1.50mL，最后加H2O2(0.03%)0.10mL啟動反應，振蕩混合，在波長510nm處測定其吸光度值A0。

向試管中加入樣品提取物溶液1.00mL，FeSO4溶液2.00mL，水楊酸-乙醇 1.50mL，最后加 H2O2（0.03%）0.10mL啟動反應，振蕩混合，水浴 37℃，保溫 30min，離心（3000r，10min），在波長510nm下測量各自的吸光度值AS。

自由基清除率計算公式為：D=（A0-AS）/A0×100%。

式中，A0為空白管的吸光度，AS為加入自由基清除劑后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 總黃酮測定結果

2.1.1 標準曲線

由圖1標準曲線可知，蘆丁含量與吸光度呈現良好的線性關系，得到回歸方程為Y=6.3x-0.0052，相關系數為r=0.9992。

圖1 蘆丁的標準曲線Fig.1 Calibration curves of rutin

2.1.2 加樣回收率考察

由表1結果可知，樣品回收率為98.58%～101.30%，均值為99.98%，RSD為1.34%，表明回收率良好，方法準確度較高。

表1 加樣回收率考察Table 1 Sample recovery rate

2.1.3 精密度考察

由表2結果可知，RSD為1.94%，表明該方法精密度良好。

表2 精密度考察Table 2 Precsion experiment

2.1.4 穩定性考察

由表3可知，吸光度值的RSD為1.64%，結果表明供試品在60 min內穩定。

表3 穩定性考察Table 3 Stability experiment

從回收率、精密度和穩定性可看出，本實驗加樣回收率、精密度及穩定性均良好，方法可行。

2.1.5 黃酮的含量測定

不同產地樺褐孔菌總黃酮含量見表4。

表4 樺褐孔菌總黃酮含量Table 4 The total flavones of Inonotus obliquus

樺褐孔菌總黃酮含量方差分析結果見表5。

表5 樺褐孔菌總黃酮含量的方差分析Table 5 Yariance analysis of the total flavones in Inonotus obliquus

由表5可知P＜0.01，故在顯著性水平0.01下，不同產地樺褐孔菌中總黃酮含量存在差異顯著性。

表6 樺褐孔菌總黃酮含量的多重比較Table6 Multiplecomparisonsof thetotal flavonesinInonotusobliquus

由表6可以看出，產地S5樺褐孔菌總黃酮平均含量最高，與產地S2無顯著差異，顯著高于產地S4，且極顯著高于產地 S6、S8、S7、S1、S3；產地 S2 平均含量次高，與產地S4無顯著差異，且極顯著高于產地產地S6、S8、S7、S1、S3、S5；產地 S1 平均含量次低，與產地 S3 無顯著差異；產地S3樺褐孔菌總黃酮平均含量最低。

2.2 抗氧化能力測定結果

表7 樺褐孔菌總黃酮對羥基自由基清除率Table 7 Radical free rate of the total flavones in Inonotus obliquus

表8 樺褐孔菌總黃酮對羥基自由基清除率的方差分析Table8 Yarianceanalysis of radical freerate of the total flavones in Inonotusobliquus

由上表可知P＜0.01，故在顯著性水平0.01下，不同產地樺褐孔菌中黃酮對羥基自由基清除能力存在差異顯著性。

表9 樺褐孔菌總黃酮對羥基自由基清除率多重比較Table9 Multiplecomparisons of radicalfreerate of the total flavonesin Inonotusobliquus

由表9可看出，產地S5樺褐孔菌中黃酮清除羥基自由基平均能力最好，與產地S7、S6、S4無顯著差異，顯著高于產地S2，且極顯著高于產地S8、S1、S3；產地S7平均能力次好，與產地S6、S4、S2無顯著差異，極顯著高于產地S8、S1、S3；產地S1平均能力次差，與產地S3無顯著差異；產地S3樺褐孔菌中黃酮清除羥基自由基平均能力最差。

3 結論

不同產地樺褐孔菌總黃酮含量測定結果表明，其含量關系為S5-吉林長白山＞S2-黑龍江黑河＞S4-黑龍江伊春＞S6-吉林吉林＞S8-日本北海道＞S7-俄羅斯西伯利亞＞S1西藏林芝＞S3-黑龍江牡丹江，各產地黃酮含量均較低，其中S5-吉林長白山樺褐孔菌中的總黃酮含量最高 (0.072μg/g)，S3-黑龍江牡丹江總黃酮含量最低(0.031μg/g)?？寡趸芰y定結果表明，S5-吉林長白山、S7-俄羅斯西伯利亞、S6-吉林吉林、S4-黑龍江伊春的總黃酮清除羥基自由基的效果均較好，無顯著差異。綜上所述，不同產地樺褐孔菌在總黃酮含量方面存在著差異，且總黃酮有一定的抗氧化能力，這為樺褐孔菌的開發利用提供一定的理論基礎。