芪芍顆粒對乙酸誘導小鼠潰瘍性結腸炎的作用研究

王曉巖 ，王丹妮 ，洪 鐵 ，*

(1.吉林省中醫藥科學院，長春130012；2.吉林大學藥學院藥理教研室，長春130021；）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種臨床常見的病因尚不十分明確的結腸和直腸非特異性炎癥性疾病，以下腹痛、便意頻繁、里急后重、粘液膿血便、肛門及直腸墜脹不適感為主要臨床癥狀。因其病因尚不完全明確，目前尚缺乏有效的治療方法，WHO將其列為現代難治病之一[1]。芪芍顆粒是吉林省中醫科學院臨床專家以傳統中醫藥理論為指導，在長期臨床實踐中總結出的經驗方。全方由黃芪、白芍、馬齒莧、敗醬草、防風等多味中藥組成。主要功能為補清并舉，補氣健脾，清熱燥濕，可使患者濕熱得解，氣機通暢。芪芍顆粒在多年臨床治療慢性腸炎及潰瘍性結腸炎方面取得了較好的療效。本研究探討芪芍顆粒對乙酸誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的影響，為芪芍顆粒治療潰瘍性結腸炎提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

BALB/c雄性小鼠，體重為18～22g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，動物許可證號：SCXK（遼）2015-0001。將小鼠于SPF級動物室適應性飼養一周，溫度為20～25℃，濕度為60%～70%，12h明暗交替照明，給予維持飼料，自由飲水。

1.2 實驗試劑

乙酸（冰醋酸）由國藥集團化學試劑有限公司生產；柳氮磺吡啶腸溶片由上海福達制藥有限公司生產；髓過氧化物酶（MPO）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、一氧化氮（NO）測試盒均由南京建成生物工程研究所提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）碧云天生物技術研究所提供；小鼠白介素1β(IL-1β)ELISA Kit、小鼠腫瘤壞死因子 α (TNF-α)ELISA KIT由武漢默沙克生物科技有限公司提供。

1.3 儀器

TU-1810紫外可見分光光度計，北京譜析通用儀器有限責任公司；S-124S電子天平，德國塞多利斯股份公司；TGL-16B離心機，上海安亭科學儀器廠；HPX-9052MBE電熱恒溫箱，上海博迅實業有限公司；F6/10超細勻漿機，上海弗魯克流體機械制造有限公司。LEICA020-518.500CM/LS顯微鏡，德國LEICA公司；OLYMPUSXOO74-1生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

2 方法

2.1 分組及給藥

取BALB/c小鼠48只，按體重隨機分為6組，每組8只，分別為空白對照組、UC模型組、陽性藥對照組（柳氮磺胺吡啶300 mg/kg）、芪芍顆粒大劑量組（14g/kg）、芪芍顆粒中劑量組（7g/kg）、芪芍顆粒小劑量組（3.5g/kg）。 各組每天上午（9：30~10：30）灌胃一次，給藥組灌胃給予相應劑量的受試物及陽性藥，空白對照組和UC模型組給予相應體積蒸餾水，連續給藥7 d。

2.2 動物模型的建立

參照文獻[2、3]略加改進對小鼠進行造模。造模前一天小鼠禁食不禁水24h，造模開始前輕揉小鼠腹部，刺激肛門，促進小鼠排便。乙醚吸入麻醉。輕提小鼠尾部，使其與水平面呈60°倒立，經小鼠肛門插入直徑1mm聚乙烯軟導管，在結腸內距肛門3.5cm處，緩慢注入5%乙酸溶液100μl，迅速拔出導管，捏緊小鼠肛門倒立2min，防止乙酸溶液漏出。造模結束后將小鼠放回籠中平躺自然蘇醒，常規飼養。空白對照組小鼠以同樣方法注入100μl生理鹽水予以對照。

2.3 統計方法

收集數據，采用SPSS17.0軟件進行分析，根據檢驗數據資料的正態性和方差齊性，定量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05時差異有統計學意義。

3 結果

3.1 對體重的影響

與空白對照組比較，UC模型組小鼠體重明顯減輕，具有顯著性差異，表明利用乙酸誘導小鼠潰瘍性結腸炎模型成功。與UC模型組比較，芪芍顆粒劑量組均能升高小鼠體重，結果見圖1。

圖1 芪芍顆粒對UC小鼠每日體重影響變化

3.2 對結腸長度、重量、腸重指數的影響

與空白對照組比較，UC模型組小鼠結腸長度及重量明顯縮短，具有顯著性差異，腸質量分數具有統計學差異，表明利用乙酸灌腸造模成功。與UC模型組比較，芪芍顆粒高劑量組顯著增加結腸長度，結腸重量有統計學差異，結果見表1。

表1 芪芍顆粒對UC小鼠結腸長度、結腸重量、腸質量指數的影響（x±s，n=8）

3.3 結腸組織病理蘇木素-伊紅（H&E）染色鏡下觀察

圖2 各組小鼠結腸HE染色情況

與空白對1照組相比，UC模型組上皮細胞破損，隱窩結構消失，粘膜及黏膜下層有大量炎癥細胞浸潤；與UC模型組相比，SASP組與芪芍顆粒高劑量組可恢復粘膜上皮結構，修復隱窩結構，減少中性粒細胞浸潤，結果見圖2。

3.4 對結腸組織中SOD活性及MPO含量的影響

與空白對照組相比，UC模型組小鼠結腸組織MPO明顯升高，具有顯著性差異；與UC模型組比較，芪芍顆粒高劑量組均能顯著降低乙酸引起潰瘍性結腸炎小鼠腸道MPO水平，具有顯著性差異。與正常組比較，模型組小鼠結腸組織SOD活性明顯降低，具有顯著性差異；與模型組比較，芪芍顆粒高劑量組均能顯著提高乙酸引起潰瘍性結腸炎小鼠SOD活性，具有顯著性差異，結果見圖3。

圖3 芪芍顆粒對UC小鼠結腸組織SOD活性、MPO含量的影響。

3.5 對結腸組織NO含量的影響

與空白對照組相比，UC模型組小鼠結腸組織中NO含量明顯升高，具有顯著性差異；與UC模型組比較，芪芍顆粒高劑量組均能顯著降低乙酸引起潰瘍性結腸炎小鼠腸道NO水平，具有顯著性差異，結果見圖4。

圖4 芪芍顆粒對UC小鼠結腸組織NO含量的影響

3.6 對結腸組織中IL-1β、TNF-α含量的影響

與空白對照組相比，UC模型組小鼠結腸組織中IL-1β、TNF-α含量明顯升高，具有顯著性差異；與UC模型組比較，芪芍顆粒高劑量組均能顯著降低乙酸引起潰瘍性結腸炎小鼠腸道IL-1β、TNF-α水平，具有顯著性差異，結果見圖5。

圖5 芪芍顆粒對UC小鼠結腸組織 IL-1β、TNF-α含量的影響。

4 討論

結腸長度及組織病理學改變是UC研究中衡量結腸損傷的重要指標，可評價藥物對UC小鼠結腸組織炎癥及損傷的治療效果。實驗結果顯示，各組末次給藥后，UC模型組結腸長度明顯縮短，HE病理染色可觀察到典型的急性炎癥表現，包括大量炎癥細胞聚集等；陽性藥柳氮磺嘧啶組和芪芍顆粒高、中、低劑量組結腸縮短現象都有好轉，且HE病理染色觀察發現結腸粘膜及黏膜下層炎癥有不同程度的減輕。提示芪芍顆粒對潰瘍性結腸炎小鼠具有治療作用。

髓過氧化物酶（MPO）是中性粒細胞特有的一種活力酶，MPO在中性粒細胞中可使H2O2生成某些氧化物，誘導中性粒細胞和巨噬細胞自身的致炎作用，使腸道炎癥進一步加重。研究中發現芪芍顆粒能降低UC模型小鼠結腸組織中的MPO含量，減少中性粒細胞的浸潤，從而改善急性潰瘍性結腸炎癥狀。超氧化物歧化酶（SOD）是細胞內主要的防御性抗氧化酶，能夠清除自由基，并可抑制自由基啟動的脂質過氧化反應，從而起到保護細胞膜結構與功能的完整作用[5]。結腸炎癥因子iNOS誘導產生大量的NO，是UC中一種重要的促炎因子。由單核巨噬細胞、肥大細胞等產生的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β 是目前公認的能介導UC發病的促炎細胞因子，它促使中性粒細胞進入腸道病變部位，引起一系列的病理變化導致UC的形成。

實驗結果表明芪芍顆粒在減輕潰瘍性結腸炎小鼠結腸炎癥的同時，結腸組織中的MPO、NO、TNF-α、IL-1β含量顯著降低，SOD含量顯著增加，提示芪芍顆粒治療潰瘍性結腸炎可能是從下調腸粘膜促炎因子（IL-1β、TNF-α、MPO 等）的表達、抑制腸粘膜氧化應激反應的發生并減少促氧化因子（NO）及增加抗氧化因子（SOD）的活力來治療潰瘍性結腸炎。關于芪芍顆粒治療潰瘍性結腸炎的機制有待進一步深入研究。