穿心蓮花粉活力測定及離體萌發特性研究

石志棉， 姬璇， 杜勤， 梁譽青， 蘇雨苗， 劉瀟晗

（廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州 510006）

穿心蓮來源于爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees，別名一見喜、斬蛇草、苦草、橄欖蓮等，為廣東道地藥材，以地上部分入藥[1]。味苦，性寒。具有清熱、解毒、涼血、消腫的功效，用于感冒發熱、咽喉腫痛、口舌生瘡、頓咳勞嗽、泄瀉痢疾、熱淋澀痛、癰腫瘡瘍、蛇蟲咬傷等病癥的治療[2]。主要化學成分為穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯等[3]。穿心蓮由于長期人工栽培，目前品種退化、產量下降、有效成分含量降低等現象嚴重[4，5]。有性繁殖是常規育種的主要方式之一，花粉作為雄配子體，它的萌發及花粉管的伸長直接影響育種成效[6]；而且花粉管便于培養和離體操作，一直是研究細胞極性生長、細胞間相互作用以及信號傳導等細胞學問題的理想模式系統[7-11]。因此，本研究以穿心蓮花粉為實驗材料，建立穿心蓮花粉體外萌發適宜培養方法。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1樣品穿心蓮花采自廣州中醫藥大學藥圃，經廣州中醫藥大學藥用植物教研室杜勤教授鑒定，為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees。

1.2試劑與儀器碘（I2，廣州化學試劑廠，批號：20151015）；碘化鉀（KI，天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20131021）；紅四氮唑（TTC，上海Macklin公司，批號：C10101070）；蔗糖（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2015032068）；硼酸（天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2015604010）；氯化鈣（天津大茂化學試劑廠，批號：201501016）；聚乙二醇6000（PEG6000，天津市致遠化學試劑有限公司，批號：20171034）；赤霉素（GA3，廣州浩瑪生物科技有限公司，批號：38035359）。YS100光學顯微鏡（日本Nikon公司）；SM2 1000體視鏡（日本Nikon公司）。

1.3實驗方法

1.3.1 I2-KI染色法測定花粉活力 配制I2-KI溶液：稱取2 g KI溶于20 mL蒸餾水中，加1 g I2全溶后，定容至300 mL。染色：剝取不同藥絲比的花藥，用小鑷子輕輕擠壓花藥，制成花粉涂片，滴1～2滴I2-KI溶液，染色5 min，10倍鏡鏡檢。染成紫色的為有活性的花粉，褐色的沒有活性，統計100粒花粉，重復3次，記錄結果。

1.3.2 TTC染色法測定花粉活力 0.5%TTC溶液的配制：精密稱量0.1 g TTC，定容至20 mL，調pH至7.7左右，現用現配。染色：剝取不同藥絲比的花藥，用小鑷子輕輕擠壓花藥，涂抹在凹形載玻片上，在花粉上滴1～2滴0.5%TTC溶液攪拌均勻；將玻片于35℃恒溫箱中放置15 min，避光染色，10倍鏡鏡檢。染成紅色的為有活性的花粉，沒有染色的沒有活性，統計100粒花粉，重復3次，記錄結果。

1.3.3 花粉管離體萌發法測定花粉活力

1.3.3.1 花粉萌發培養液優化 采用正交設計法[12]，考察 100、150、200 g/L 蔗糖，0.1、0.3、0.5 g/L 氯化鈣，0.5、1、2 g/L 硼酸，50、100、150 g/L PEG6000質量濃度梯度對穿心蓮花粉萌發的影響。正交試驗設計因素水平安排表及試驗方案見表1、2。

按表2分別配制100 mL花粉萌發培養液。將配制好的培養液均勻滴在凹形載玻片中間備用。采集即將開放或已開放（即藥絲比1∶6）的小花，用鑷子擠壓花藥，使花粉均勻撒在培養液上，（25±2）℃配合2000 Lux光照（光照10 h，黑暗14 h）培養24h，在10倍鏡下鏡檢。以花粉管長度超過花粉直徑為萌發，統計100粒花粉的萌發情況，重復3次。

表1 花粉管萌發正交試驗設計因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal test design for pollen tube germination[ρ/（g·L-1）]

表2 花粉管萌發正交試驗方案Table 2Orthogonal test scheme for pollen tube germination[ρ/（g·L-1）]

1.3.3.2 GA3質量濃度對花粉管萌發的影響 以上述正交試驗得出的最佳組合為基礎培養液配方，分別加入0.001、0.01、0.1 g/L GA3，考察不同質量濃度GA3對花粉管萌發的影響。

1.3.3.3 預處理對花粉管萌發的影響 采用正交試驗設計統計得出的最佳培養液組合，均勻滴在凹形載玻片中間。選取即將盛開或已盛開的小花，分別進行4℃冷預處理24、48 h，30℃熱預處理24、48 h，不處理。剝去花藥，用小鑷子輕輕擠壓花藥，將花藥均勻撒在培養液上，在27℃下培養24 h。在顯微鏡下觀察花粉管萌發情況，每個視野統計100粒花粉，重復3次，記錄結果。

1.3.3.4 光培養與暗培養對穿心蓮花粉管萌發的影響 采用正交試驗設計統計得出的最佳培養液組合，均勻滴在凹形載玻片中間。選取經最適預處理的即將盛開或已盛開的小花，剝去花藥，用小鑷子輕輕擠壓花藥，將花藥均勻撒在培養液上，在光照及黑暗的條件下培養24 h。在顯微鏡下觀察花粉管萌發情況，每個視野統計100粒花粉，重復3次，記錄結果。

1.3.3.5 花粉管萌發法測定穿心蓮花粉活性 采用正交試驗設計統計得出的最佳培養液，均勻滴在凹形載玻片中間。分別在8:00、15:00 2個時間段采集藥絲比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6 的4種小花，經最適預處理后備用。將完成預處理的小花，剝去花藥，用小鑷子輕輕擠壓花藥，將花藥均勻撒在培養液上，在最適條件下培養24 h。在顯微鏡下觀察花粉萌發情況，每個視野統計100粒花粉，重復3次，記錄結果。

2 結果

2.1I2-KI染色法測定穿心蓮花粉活力用I2-KI染色法測定穿心蓮花粉活力，試驗結果見表3、圖1。

由表3、圖1可知，15:00采集的藥絲比為1∶4的花粉染色率最高，而8:00采集的藥絲比為1∶6的花粉染色率最低，花粉活性隨藥絲比的減小呈先增高后下降的趨勢，相同藥絲比的小花，15:00采集的花粉活性比8:00采集的花粉高。

2.2TTC染色法測定穿心蓮花粉活力用TTC染色法測定穿心蓮花粉活力，試驗結果見表4、圖2。

由表4、圖2可知，15:00采集的藥絲比為1∶6的花粉染色率最高，而15:00采集的藥絲比為1∶1的花粉染色率最低，花粉活性隨藥絲比的減小呈增高的趨勢，相同藥絲比的小花，15:00采集的花粉活性比8:00采集的花粉高。

2.3花粉管離體萌發法測定穿心蓮花粉活力

2.3.1 花粉管離體萌發培養液優化 考察100、150、200 g/L蔗糖質量濃度梯度，0.1、0.3、0.5 g/L氯化鈣質量濃度梯度，0.5、1、2 g/L硼酸質量濃度梯度，50、100、150 g/L PEG6000質量濃度梯度對穿心蓮花粉萌發率的影響。試驗結果及分析見表5。

表3 I2-KI染色法測定穿心蓮花粉活力Table 3 The results for the vitality of Andrographis paniculata pollen determined by I2-KI staining method （n=3）

圖1 穿心蓮花粉I2-KI染色結果（×100）Figure 1 The I2-KI staining results for Andrographis paniculata pollen（×100）

表4 TTC法測定花粉活力Table 4 The results for the vitality of Andrographis paniculata pollen determined by TTC method（n=3）

圖2 穿心蓮花粉TTC染色結果（×100）Figure 2 The TTC staining results for Andrographis paniculata pollen（×100）

從直觀分析可得，4個因素對穿心蓮花粉管萌發率的影響從大到小的排列為：蔗糖質量濃度＞硼酸質量濃度＞氯化鈣質量濃度＞PEG6000質量濃度。試驗得出的最佳組合是A1B2C2D3，即蔗糖100 g/L、氯化鈣0.3 g/L、硼酸1.0 g/L、PEG6000 150 g/L。對最佳組合進行驗證試驗，穿心蓮花粉萌發率為82.5%，高于上述9組試驗的萌發率。對試驗結果進行方差分析，結果見表6。

由表6可知，A因素（蔗糖）、B因素（氯化鈣）、C因素（硼酸）對穿心蓮花粉萌發有顯著性意義（P＜0.05），其中A因素（蔗糖）具有非常顯著性意義（P＜0.01）。

2.3.2 GA3質量濃度對花粉管離體萌發的影響 以上述正交試驗得出的最佳組合（蔗糖100 g/L，氯化鈣0.3 g/L，硼酸1.0 g/L，PEG6000 150 g/L）為基礎培養液配方，分別加入 0.001、0.01、0.1 g/L GA3，考察不同質量濃度GA3對花粉管萌發的影響。試驗結果見表7。

由表7可知，加入不同質量濃度GA3后，花粉管萌發率與對照組相比，花粉萌發率沒有顯著增高，但是通過觀察，發現花粉萌發的時間大大縮短。加入GA3后，花粉管畸形化、彎曲化嚴重，不利于花粉管的觀察與統計。

2.3.3 預處理對花粉管離體萌發的影響 采用正交試驗設計統計得出的最佳培養液組合，均勻滴在凹形載玻片中間。選取即將盛開或已盛開的小花，分別進行4℃冷預處理24、48 h，30℃熱預處理24、48 h，不做處理的為對照組，剝取花粉進行培養，試驗結果見表8。

表5 穿心蓮花粉管離體萌發試驗結果Table 5 In-vitro test results for Andrographis paniculata pollen tube germination （n=5）

表6 花粉管離體萌發正交試驗方差分析Table 6 Variance analysis for orthogonal test of in-vitro germination of pollen tube

表7 GA3質量濃度對花粉管離體萌發的影響Table 7 Effects of different GA3 concentrations on in-vitro pollen tube germination （n=3）

由表8可知，與對照組（不處理）比較，4℃冷處理24 h能顯著提高花粉管萌發率。4℃冷處理48 h與30℃熱處理24 h的穿心蓮花粉管萌發率與對照組比較，無顯著性差異。但通過30℃熱處理48 h組可得出，隨著熱處理時間的增長，花粉管萌發率下降，花粉活力降低。

表8 預處理對花粉管離體萌發的影響Table 8 Effects of pretreatments on in-vitro pollen tube germination （n=3）

2.3.4 光培養與暗培養對穿心蓮花粉管萌發的影響 采用正交試驗設計統計得出的最佳培養液組合，均勻滴在凹形載玻片中間。選取經24 h 4℃預冷處理的即將盛開或已盛開的小花，剝取花粉，在（25±2）℃配合2 000 Lux光照（光照10 h，黑暗14 h）條件下培養24 h。在顯微鏡下觀察花粉管萌發情況，試驗結果見表9。對表9試驗結果進行分析，光培養與暗培養對穿心蓮花粉管萌發無顯著影響（P＞0.05）。

2.3.5 花粉管萌發法測定穿心蓮花粉活性 采用正交試驗設計統計得出的最佳培養液，均勻滴在凹形載玻片中間。分別在8:00、15:00 2個時間段采集藥絲比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6 的4種小花。4℃預冷處理24 h后，剝取花粉，進行培養，在顯微鏡下觀察花粉管離體萌發情況，試驗結果見表10，圖3、4。

表9 光照條件對花粉管離體萌發的影響Table 9 Effects of lighting conditions on in-vitro pollen tube germination （n=3）

表10 花粉管萌發法測定穿心蓮花粉活性Table 10 The results for Andrographis paniculata pollen activity determined by pollen tube germination method （n=3）

由表10可知，8：00與15：00 2個時間點采集的4個生長時期花粉統計結果均以藥絲比為1∶6的花粉管離體萌發率最高，即該時期花粉活力最強；藥絲比為1∶1時花粉管萌發率最低，即該時期花粉活力最低。花粉管離體萌發率均隨著藥絲比的減小而呈增高趨勢。但是對2個采集時間比較顯示，8：00采集的4種藥絲比的小花的花粉管離體萌發率均比15：00時采集的高，所以在8：00采集藥絲比為1∶6的小花即可獲得花粉活力最高的小花。

3 討論

圖3 穿心蓮花粉萌發過程（×400）Figure 3 The germination process of Andrographis paniculata pollen tube（×400）

圖4 培養24 h后穿心蓮花粉管形態（×100）Figure 4 The morphology feature of Andrographis paniculata pollen tube after 24-h culture（×100）

花粉體外萌發法是花粉活力鑒定常用的方法，其方法簡便，萌發條件易控制[13-16]。花粉萌發一般需要碳水化合物，最常用的是蔗糖[17，18]，一方面保持滲透壓，另一方面作為新陳代謝的底物，提供能量。硼和鈣對于花粉管的伸長和生長液具有明顯的促進作用[19-21]。同時也可以使用PEG6000調節穿心蓮花粉的滲透壓[22-26]，有助于穿心蓮花粉管的萌發。

本研究中，TTC法測定的花粉活力趨勢與花粉管離體萌發法測定的花粉活力趨勢相同，均為花粉活力隨著藥絲比的減少而呈增高趨勢。但在小花采集時間的測定上兩者結果不一致，通過TTC法測定，最佳活力的小花為15：00采集的藥絲比為1∶6的小花，但通過花粉管萌發法測定的結果則為8：00采集的藥絲比為1∶6的小花。由于TTC法原理是通過測定脫氫酶活性從側面反映花粉活性，所以試驗結果可能會存在偏差[27-30]，而花粉萌發法則是通過花粉管是否萌發直接反映花粉活力的，所以試驗結果較TTC法可信。TTC法的檢測時間較短，而花粉管萌發法則需要8～24 h的培養時間，檢測時間較長，因此TTC法在快速檢測花粉活性上具有優勢，但是精確研究花粉活性仍應選擇花粉管萌發法。

I2-KI染色法比起上述2種檢測方法，其原理是通過對花粉內淀粉進行染色從而判定花粉活力，但是花粉內所含淀粉量與花粉活力之間的聯系目前尚未明確[31-35]，因此使用該方法測定花粉活性，可能會存在較大的偏差，不建議使用。