2種質量濃度DSS致急性潰瘍性結腸炎大鼠模型的構建與比較

王倩， 包永欣

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧沈陽 110847；2.北部戰區總醫院，遼寧沈陽 110840）

目前，我國罹患潰瘍性結腸炎（UC）的人數逐年上漲，但其病因和具體機制尚不明確，選取合適的實驗性動物模型成為研究此病的關鍵。在諸多研究UC的動物模型中，葡聚糖硫酸鈉（DSS）以其造模方法簡便、癥狀表現與人體近似等諸多優勢脫穎而出。DSS濃度是UC造模成功的關鍵因素，但DSS的濃度不易掌握，嚴重影響UC模型的質量。在眾多DSS誘導UC大鼠的報道中，DSS的質量濃度以30～50 g/L居多，故在研究急性UC實驗性大鼠的造模時，本課題組選取30 g/L的DSS和50 g/L的DSS這2個臨界值作為研究和對比的對象，對急性UC的造模濃度進行摸索和研究。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性SD大鼠30只，體質量200～250 g，購自遼寧長生生物技術有限公司，動物質量合格證號：SCXK（遼）2015-0001。于遼寧中醫藥大學科研實驗中心飼養，實驗室通風、采光良好，溫度22～23℃，濕度40%～50%。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

1.2實驗試劑DSS，大連美侖生物公司生產（批號：9011-18-1），分子質量36 000～50 000，pH 5.0～7.0，水分＜10%，應用時分別配制成質量濃度為30、50 g/L。

1.3分組與造模將30只大鼠隨機分為空白組、DSS低濃度組、DSS高濃度組，每組各10只。DSS低濃度組、DSS高濃度組大鼠分別給予飲用質量濃度為30、50 g/L的DSS，空白組給予大鼠自由飲用蒸餾水，均連續7 d。若大鼠出現稀便、便膿血（肉眼血便或大便隱血陽性）等指征即判斷造模成功。

1.4大鼠一般狀態觀察、疾病活動指數（DAI）評估觀察并記錄每只大鼠每日的體質量、大便性狀和便血情況。參照Cooper等[1]的評分系統進行DAI評分，見表1。DAI=（體質量下降率分數+大便性狀分數+便血分數）/3。通過統計及分析DAI評估UC大鼠的一般活動情況。

1.5結腸組織損傷程度的評估大鼠自由飲用DSS 7 d后，禁食不禁水，用100 g/L水合氯醛腹腔麻醉，采用脫頸法致大鼠猝死，剖腹，迅速截取從肛門以上至結腸8～15 cm處結腸組織；用手術剪沿腸系膜縱行線剪開，用冷生理鹽水將腸壁沖洗干凈，用解剖鏡觀察結腸形態學觀察，并測量結腸長度。取每只大鼠結腸病變最嚴重處進行病理切塊（2 mm×10 mm），常規石蠟包埋，切片，4 μm進行蘇木素—伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察結腸組織病理改變程度。組織損傷程度可用炎癥、病變深度、隱窩破壞與病變范圍的評分的乘積表示。結腸黏膜損傷指數（CMDI）的評分標準[2]見表2。

表1 DAI評分標準Table 1 DAI scoring criterion

表2 CMDI的評分標準Table 2 CMDI scoring criterion

1.6統計方法采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1大鼠一般狀態DSS低濃度組和DSS高濃度組大鼠均出現UC的急性期癥狀表現：懶動、食量下降、反應遲鈍、毛色灰暗不澤、血便、稀便等。DSS低濃度組大鼠UC癥狀表現較DSS高濃度組輕微。DSS高濃度組大鼠于自由飲用DSS第3天開始出現明顯的UC癥狀，腹瀉和糞便隱血試驗陽性，第4～7天可見明顯的肉眼血便。DSS低濃度組大鼠于自由飲用DSS第5天開始出現明顯的UC癥狀，糞便隱血試驗陽性、出現腹瀉，第6～7天可見明顯肉眼血便。空白組大鼠一般狀態正常。

2.2大鼠DAI評分表3結果顯示，與空白組比較，DSS低濃度組和DSS高濃度組的DAI評分均上升（P＜0.05），且DSS高濃度組的DAI評分高于DSS低濃度組（P＜0.05）。表明30 g/L DSS和50 g/L DSS均可對UC大鼠產生損傷作用。30 g/L DSS所致大鼠結腸損傷程度較輕微，大便隱血呈陽性反應，肉眼血便較少；而50 g/L DSS所致結腸損傷程度較嚴重，肉眼血便明顯。

表3 各組大鼠DAI評分比較Table 3 Comparison of DAI scores in various groups (±s)

表3 各組大鼠DAI評分比較Table 3 Comparison of DAI scores in various groups (±s)

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與DSS低濃度組比較

DAI評分（s/分）0 1.99±0.994①3.50± 0.527①②組別空白組DSS低濃度組DSS高濃度組N 10 10 10

2.3大鼠結腸一般形態學表現DSS低濃度組、DSS高濃度組大鼠結腸均有充血、水腫、縮短變窄、潰瘍、瘀斑等表現。其中：DSS低濃度組大鼠結腸水腫、充血程度較輕，瘀血和潰瘍較少，結腸形態改變度小；DSS高濃度組大鼠結腸損傷較為嚴重，結腸廣泛糜爛、潰瘍，明顯的黏膜水腫，瘀點瘀斑散在結腸黏膜上。空白組大鼠結腸形態無改變。

2.4大鼠結腸長度表4結果顯示：與空白組比較，DSS低濃度組和DSS高濃度組的結腸長度均縮短（P＜0.05），且DSS高濃度組結腸長度縮短程度明顯（P＜0.05）。表明30 g/L DSS和50 g/L DSS均可對UC大鼠結腸長度產生影響，均可造成結腸長度縮短，而50 g/L DSS所致模型的結腸損傷較30 g/L DSS更為嚴重。

表4 各組大鼠結腸長度比較Table 4 Comparison of the colon length in various groups (±s)

表4 各組大鼠結腸長度比較Table 4 Comparison of the colon length in various groups (±s)

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與DSS低濃度組比較

結腸長度（l/cm）3.480±0.3834 2.540±0.1673①1.460± 0.114①②組別空白組DSS低濃度組DSS高濃度組N 10 10 10

2.5大鼠結腸病理學改變大鼠自由飲用DSS 7 d后，DSS低濃度組的結腸炎癥程度較輕微，病變深度大多可達肌層，基底隱窩破壞面積較小，病變范圍也相應較小，結腸損傷程度較輕微；與DSS低濃度組比較，DSS高濃度組結腸組織炎癥呈重度表現，病變深度可達漿膜層，隱窩破壞擴大，上皮組織被破壞；空白組大鼠結腸病理學無明顯改變。

2.6大鼠結腸CMDI評分表5結果顯示，與空白組比較，DSS低濃度組和DSS高濃度組CMDI評分均上升（P＜0.05），且DSS高濃度組CMDII評分高于DSS低濃度組（P＜0.05）。表明30、50 g/L均可對UC大鼠產生損傷作用，但50 g/L DSS造成的結腸損傷更嚴重。

表5 各組大鼠CMDI評分比較Table 5 Comparison of CMDI scores in various groups(±s)

表5 各組大鼠CMDI評分比較Table 5 Comparison of CMDI scores in various groups(±s)

①P＜0.05，與空白組比較；②P＜0.05，與DSS低濃度組比較

CMDI評分（s/分）0 6.60±2.547①12.60± 2.319①②組別空白組DSS低濃度組DSS高濃度組N 10 10 10

3 討論

UC是炎癥性腸病的一種，對腸內容物產生異常的免疫應答是其致病機制的特點。異常的免疫應答可致結直腸黏膜出現潰瘍和慢性炎癥，從而引起腹瀉、腹痛、體質量下降、直腸出血、貧血等癥狀[3-7]。目前，UC的病因和發病機制尚不十分明確，即尚未發現明確的與UC密切相關的特異性因子，故而選擇理想的實驗動物模型無疑是研究UC的最佳途徑之一，而實驗模型在一定程度上甚至可以引領某一領域、某一疾病的發展。

在對UC的造模方法中，DSS方法簡便、重復性好，具有與人類的UC癥狀相近似的優勢。DSS是由日本學者Ohkusa T[8]于1985年發現的UC造模方法，此后，Okayasu I等[9]于1990年成功建立了DSS誘導的UC小鼠模型。DSS是由蔗糖合成、具有抗凝血和抗止血作用的肝素樣硫酸多醣體，其分子式為（C6H7Na3O14S3）n，含硫量一般為16%～20%，極易溶于水（100 g/L），需在室溫保存。

DSS可用于UC的急、慢性動物模型的制作研究。短時間予以小鼠高濃度的DSS溶液可建立急性UC模型，長時間給予低濃度DSS可建立慢性UC模型。但不同濃度DSS所造成的實驗性UC大鼠的癥狀表現各異，結腸損傷的嚴重程度輕重不一，其癥狀表現和結腸損傷程度缺乏穩定性。鑒于目前缺乏UC穩定的實驗性動物模型及成模標準，沒有DSS濃度的統一規范。因此，有必要探討DSS誘導實驗性UC大鼠的最佳濃度，進而為UC的研究提供實驗基礎，亦便于本課題組后續課題的開展。

本研究DAI評分結果顯示：30 g/L DSS所致大鼠結腸損傷輕微，大便隱血呈陽性反應，肉眼血便較少，結腸損傷程度較輕微；而DSS高濃度組的結腸損傷更為嚴重，肉眼血便明顯。CMDI評分結果顯示：DSS低濃度組的結腸損傷輕微，炎癥程度較輕微，病變深度大多可達肌層，基底隱窩破壞面積較小，病變范圍也相應較小，結腸損傷程度較輕微；與DSS低濃度組比較，DSS高濃度組的結腸組織呈重度炎癥的表現，病變深度隨著時間的延長而加深，炎性物質的浸潤由黏膜下層逐漸浸潤至肌層和漿膜層，隱窩破壞擴大，上皮組織破壞程度逐漸加深。鑒于30 g/L DSS即可成功誘發急性UC，因此，選用質量濃度為30 g/L的DSS造模更合適。