黃芪、穿心蓮單獨或與抗菌肽LL-37聯合應用對銅綠假單胞菌生物膜的影響

肖倩， 王展強， 吳行貴， 張偉錚， 石文， 張軒， 羅燕芬， 陳茶

（1.廣東省中醫院檢驗醫學部，廣東廣州 510120；2.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東廣州 510006；3.廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣東廣州 510006）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）作為一種常見的醫院獲得性感染的革蘭氏陰性條件致病菌，常引起呼吸道、消化道感染，危害人類的健康[1，2]。研究發現PA生物被膜（biofilm）形成時，抗藥性增強甚至耐藥[3-5]。目前在臨床上治療PA感染仍具有挑戰性，一方面是因為多重耐藥菌株日益增多，抗生素治療陷入困境，另一方面是因為抗生素的不合理使用，使PA感染患者病情遷延難治。隨著“抗生素后時代”的到來，人們開始更多地求助于非抗生素治療。黃芪（補益類中藥）、穿心蓮（清熱解毒類中藥）是臨床方劑配伍中常用的2味中藥，均具有抑菌殺菌、增強機體免疫作用[6，7]。有研究發現，抗菌肽LL-37是在人體內唯一發現的內源性抗菌肽，具有廣譜的抗微生物活性和中和脂多糖的活性[8-12]。因此，本研究以銅綠假單胞菌為研究對象，以抗菌肽LL-37[13]為陽性對照，觀察中藥黃芪、穿心蓮單獨使用或與抗菌肽LL-37聯合應用對銅綠假單胞菌生物膜的作用，評價黃芪、穿心蓮抗銅綠假單胞菌性能，探討其與抗菌肽LL-37是否有協同作用，為新藥物開發應用提供新策略。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗菌株銅綠假單胞菌野生菌株PAO1為重慶醫科大學附屬兒童醫院鄒琳教授惠贈。

1.2主要試劑與儀器黃芪（批號：170800541）、穿心蓮（批號：16110864）均購自康美藥業股份有限公司；抗菌肽LL-37（批號：JT69395）購自南京杰肽生物科技有限公司。Multiskan FC酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3不同濃度中藥的配制分別用去離子水浸泡黃芪、穿心蓮1 h（每100 g中藥加500 mL去離子水）。用中藥煲煎制1 h，冷卻后用無菌濾膜過濾，除去細菌。用LB培養基將中藥原液稀釋2、4、8倍，分別配成高、中、低3種質量濃度（100、50、25g/L），置4℃保存，備用。

1.4野生菌株PAO1生物膜培養取-80℃保存的PAO1于血平板上復蘇，37℃培養24 h，進行菌落形態觀察、革蘭染色、初步生化反應。挑取血平板上各單個菌落，在LB培養基中進行增菌，調至0.5麥氏濃度，備用。取出配好的菌液恢復至室溫，用LB培養基稀釋菌液100倍，置于37℃恒溫搖床中平衡1 h。將長寬約0.5 mm無菌硅膠片置于24孔板中，將平衡后的菌液以1 000 μL/孔加入24孔板中，復孔6個，于CO2培養箱中培養7 d[14]，隔天換液，用于后續實驗。

1.5紫外分光光度法鑒定PAO1生物膜參考Jabalameli F等的方法[15]，取出培養PAO17 d的24孔板，棄去LB培養基。用滅菌注射用水清洗硅膠片2次以除去浮游菌，拍干后置于新的24孔板中，同時用無菌硅膠片作為陰性對照。在24孔板中以500 μL/孔加入結晶紫以固定生物膜并染色，3 min后棄去結晶紫，用滅菌注射用水清洗硅膠片3次，置于新的24孔板中，自然風干。向24孔板中以200 μL/孔加入300 g/L醋酸，置于搖床上15 min。混勻后，每孔吸取100 μL溶液于96孔板。應用酶標儀測量吸光度[D（630 nm）]，記錄實驗結果。

1.6最小抑菌濃度（MIC）測定采用微量肉湯稀釋法檢測黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37對銅綠假單胞菌PAO1的MIC。取出配好的菌液恢復至室溫，每孔加入濃度為2×106CFU/mL的對數生長期菌液100 μL。調整黃芪、穿心蓮各質量濃度分為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0 g/L；調整抗菌肽LL-37質量濃度分為1 024、512、256、128、64、32、16、0 μg/mL；無菌生理鹽水孔為陰性對照組，加菌液不加藥孔為空白對照組。以1∶1的比例加入96孔板中，每個濃度復孔3個，混勻置于CO2培養箱中過夜觀察結果，有細菌生長孔混濁，無細菌生長孔清亮且對應的最小用藥濃度即為MIC值。

1.7黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨或聯合用藥對PAO1生物膜形成的影響實驗分組：黃芪、穿心蓮單獨用藥組（劑量均分別為100、50、25 g/L）；抗菌肽LL-37單獨用藥組（劑量分別為128、64、32、16 μg/mL）；聯合用藥組（64、32 μg/mL抗菌肽LL-37+100、50、25 g/L黃芪或穿心蓮）。另設無菌生理鹽水孔為陰性對照組，未加藥PA生物膜孔為空白對照組。將無菌硅膠片置于24孔板中，取出配好的菌液和各組藥物以1∶1的比例加入24孔板中，設3個復孔。按“1.4”項制備生物膜。應用酶標儀測定吸光度D（630 nm）值。聯合用藥時計算抑菌濃度指數（FIC）[16]（FIC=D聯合后/D聯合前，當FIC≤0.5時，表示二者有協同作用）。

1.8黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨或聯合用藥對成熟生物膜的清除率用“1.4”項的方法培養生物膜若干，第7天時取出生物膜，置于新的24孔板中。PAO1野生菌株分別培養于隨機選擇的3塊硅膠片。采用紫外分光光度法測定各孔D（630 nm），檢驗生物膜的形成能力，再將各濃度藥物以每孔1 000 μL加入24孔板中，設3個復孔，24 h后再檢驗生物膜的形成能力。按以下公式計算生物膜清除率（p）：p=[藥物處理后D（λ）-藥物處理前D（λ）]/藥物處理前D（λ）×100%。聯合用藥時計算FIC。

1.9統計方法采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數±標準差(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1紫外分光光度法檢測銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成情況圖1結果顯示：PAO1組D（630 nm）高于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示野生菌株PAO1形成生物膜。

2.2黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37最低抑菌濃度表1結果顯示，各實驗濃度中藥黃芪、穿心蓮對PAO1無抑制作用，抗菌肽LL-37對PA的MIC為256 μg/mL。

2.3單獨用藥、聯合用藥對PA生物膜形成的影響

2.3.1 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1生物膜形成的影響 圖2結果顯示：與空白對照組比較，不同濃度的黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥組D（630 nm）值顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），且穿心蓮組、抗菌肽LL-37組降低作用更明顯；各藥物不同濃度組間D（630 nm）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示不同濃度黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥對野生菌株PAO1生物膜形成均具有抑制作用。

表1 黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37最低抑菌濃度的測定結果Table 1 The minimum inhibitory concentration of Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37

圖1 紫外分光光度法測PAO1生物膜形成情況Figure 1 UV spectrophotometric determination results of PAO1 biofilm formation

2.3.2 黃芪與抗菌肽LL-37聯合用藥對PAO1生物膜形成的影響 圖3結果顯示，25、50、100 g/L的黃芪分別與32、64 μg/mL的抗菌肽LL-37聯合用藥不能抑制生物膜的形成。

2.3.3 穿心蓮與抗菌肽LL-37聯合用藥對PAO1生物膜形成的影響 圖4結果顯示：與空白對照組比較，100 g/L穿心蓮+64 μg/mL抗菌肽LL-37、100 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、50 g/L穿心蓮+32 μg/mL 抗菌肽LL-37、25 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37聯合用藥組D（630 nm）值顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示穿心蓮與抗菌肽LL-37聯合用藥可抑制生物膜的形成，但FIC＞0.5，又提示聯合用藥并未產生協同作用。

2.4單獨用藥、聯合用藥對PAO1成熟生物膜的清除率

2.4.1 黃芪、穿心蓮和抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1成熟生物膜的清除率 表2結果顯示：單用黃芪（100、50、25 g/L）對PAO1成熟生物膜的清除率分別為-47.88%、-40.21%、-43.92%，清除近一半成熟生物膜；各濃度黃芪組清除率比較，差異不明顯。穿心蓮（100、50、25 g/L），抗菌肽LL-37（128、64、32、16 μg/mL）對PAO1成熟生物膜的清除率在29%～60%之間，均大于29%；隨著穿心蓮濃度的增加，PAO1成熟生物膜清除率逐漸減弱，而隨著抗菌肽LL-37濃度的增加，PAO1成熟生物膜清除率逐漸增強。

圖2 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1生物膜形成的影響Figure 2 Effect of Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 alone on PAO1 biofilm formation

圖3 黃芪與抗菌肽LL-37聯合用藥對PAO1生物膜形成的影響Figure 3 Effects of the combination of Radix Astragaliand antibacterial peptide LL-37 on PAO1 biofilm formation

圖4 穿心蓮與抗菌肽LL-37聯合用藥對PAO1生物膜形成的影響Figure 4 Effects of the combination of Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 on PAO1 biofilm formation

表2 黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1成熟生物膜的清除率比較Table 2 Comparison of the clearance rate of PAO1 mature biofilm by Radix Astragali，Herba Andrographis and antibacterial peptide LL-37 alone

2.4.2 黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯合用藥對PAO1成熟生物膜的清除率 表3結果顯示，25 g/L黃芪+32 μg/mL抗菌肽LL-37組和25 g/L黃芪+16 μg/mL抗菌肽LL-37組對PAO1成熟生物膜的清除率均大于25%，其他聯合組對PAO1成熟生物膜的清除作用不理想。FIC＞0.5，提示聯合用藥抗PAO1成熟生物膜形成亦不產生協同作用。

3 討論

PA的群體感應系統（quorum sensing system，QS系統）在細菌致病性和耐藥性方面發揮重要作用，具有調控細菌粘附、毒力因子分泌、生物膜形成等功能[17，18]。生物膜是由細菌產生的基質封閉并粘附于彼此表面或分界面的細菌群落。生物膜形成后，環境適應能力更強，一方面增加對附著面的粘附性，逃避宿主的免疫作用，另一方面阻止藥物進入到細菌內部，使細菌耐藥性顯著增強。有研究指出，PA的慢性感染主要與生物膜這一生長模式、低毒性和生長速度慢有關，某些情況下生物膜對PA的毒力效應具有更強的協同作用[19，20]。因此，破壞菌膜的多細胞結構是清除菌膜的主要治療思路，干擾細胞信號系統也是一個很有前景的途徑。

表3 黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯合用藥對PAO1成熟生物膜的清除率Table 3 Comparison of the clearance rate of PAO1 biofilms by the combination of Radix Astragali/Herba Andrographis together with antibacterial peptide LL-37

近年來，中藥已成為研究抑菌藥物的來源之一[21]，其優勢在于中藥某些成分具有天然抗菌抑菌活性。有文獻報道，中藥黃芪[22]、穿心蓮[23，24]從多個方面對PA的毒力因子、生物膜形成產生廣泛抑制作用。因此，在目前PA抗生素耐藥正處于嚴峻的形勢下，進一步深入研究PA的致病機制以及尋找針對PA感染的非抗生素治療具有重要的科學意義和臨床價值。

本研究首先成功構建了穩定生物膜模型，應用紫外分光光度法測定生物膜形成能力，結果顯示PAO1組D（λ）和陰性對照組D（λ）分別為（0.126 3±0.015 2）和（0.036 0±0.001 5），按照Jabalameli F[15]的判斷標準，PAO1能形成生物膜且形成生物膜的能力為中等[2×空白對照組D（λ）＜實驗組D（λ）≤4×空白對照組D（λ）]，表明其形成的生物膜比較穩定。

再者，黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥對PAO1野生菌株生物膜的形成均具有抑制作用。穿心蓮和抗菌肽LL-37的抑制作用更明顯。各藥物不同濃度組間D（630 nm）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但D（630 nm）隨著濃度增加呈現減低趨勢，表明隨著PAO1生物膜的形成減少，藥物抑制生物膜形成能力增強，提示黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥可抑制PAO1生物被膜的起始，在生物膜形成的第一步就發揮了重要的干預作用，呈現濃度依賴效應，與文獻[21]報道相符。該文獻[21]也報道高濃度黃芪提取液對吸光度造成干擾，同時低濃度（＜50g/L）黃芪對吸光度不造成干擾，顯示這種干擾程度在一定范圍內較為恒定。本研究選取的黃芪濃度亦在此恒定范圍內。

本研究觀察聯合用藥抑制生物膜形成的結果顯示：選取25、50、100 g/L的黃芪分別與32、64 μg/mL的抗菌肽LL-37聯合用藥不能抑制生物膜的形成；100 g/L穿心蓮+64 μg/mL抗菌肽LL-37、100 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、50 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37、25 g/L穿心蓮+32 μg/mL抗菌肽LL-37聯合用藥均能抑制生物膜的形成，差異有統計學意義（P＜0.05）。表明在生物膜形成早期，聯合應用一定濃度的穿心蓮+抗菌肽LL-37具有明顯的抑制作用；但是聯合用藥尚未產生協同作用（FIC＞0.5），提示二者配伍使用不能達到較好的抑菌作用。

本研究觀察黃芪、穿心蓮、抑菌肽LL-37單獨用藥對已經形成的成熟PAO1生物膜的清除作用，用清除率表示。黃芪（100、50、25 g/L）對PAO1成熟生物膜的清除率分別為-47.88%、-40.21%和-43.92%，清除近一半成熟生物膜。穿心蓮（100、50、25 g/L）、抗菌肽LL-37（128、64、32、16 μg/mL）對PAO1成熟生物膜的清除率均在29%～60%之間，均大于29%。黃芪各濃度的清除作用差異不明顯。穿心蓮隨濃度增加，對PAO1成熟生物膜的清除作用反而減弱。抗菌肽LL-37隨濃度增加，對PAO1成熟生物膜的清除作用越明顯，具有濃度依賴性，顯示出抗菌肽LL-37預防和治療難治性生物膜感染的巨大潛力。

本研究觀察聯合用藥對成熟生物膜抑制作用，研究結果顯示，25 g/L黃芪+32 μg/mL抗菌肽LL-37、25 g/L黃芪 +16 μg/mL 抗菌肽LL-37對PAO1成熟生物膜的清除率均大于25%。其他聯合組對PAO1成熟生物膜的清除作用不理想，對此現象有待進一步探討。聯合用藥抗PAO1成熟生物膜形成也不產生協同作用（FIC＞0.5）

綜上所述，黃芪、穿心蓮、抗菌肽LL-37單獨用藥均能夠早期抑制PAO1生物膜的形成，呈現濃度依賴性，并且在一定程度上清除成熟的生物膜。黃芪/穿心蓮與抗菌肽LL-37聯合應用時，不具有協同作用。下一步擬在動物實驗中以驗證其效。