電針對食源性肥胖大鼠下丘腦自噬相關蛋白7表達的影響

姚俊鵬， 李瑛， 張林

（1.成都中醫藥大學，四川成都 610075；2.成都中醫藥大學第三附屬醫院四川省糖尿病防治中心內科，四川成都 610041）

最新的資料發現中國的肥胖人數位居世界第一[1]，與肥胖相關的心腦血管等疾病的患病率呈明顯增加趨勢。針刺治療肥胖切實有效[2]。越來越多的證據發現，下丘腦內自噬與肥胖關系密切[3]。長期高脂飲食誘導的肥胖C57BL/6小鼠與正常飲食小鼠相比，下丘腦弓狀核內自噬相關蛋白減少[4]。去血清營養條件下培養下丘腦GT1-7細胞，自噬表達增加[5]。本課題從自噬的角度探討針刺治療肥胖的機制。

1 材料與方法

1.1動物雄性SD大鼠40只，SPF級，3～4周齡，體質量70～90 g，成都達碩生物科技有限公司提供，動物許可證號：SCXK（川）2013-24。動物飼養于成都中醫藥大學實驗動物中心，明暗周期各12 h，自由攝食飲水。

1.2試劑及儀器硝酸纖維素膜，美國Hybond公司；自噬相關蛋白7（Autophagy-related protein 7，Atg7）抗體，生物素化山羊抗兔IgG（H+L）抗體，英國abcam（上海）貿易有限公司產品，批號分別為ab133528，ab6721和ab6789；辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素（HRP/A-V），北京中杉金橋生物有限公司，批號：13152A11。DYY-6C電泳儀（美國Bio-RAD公司），UVTransilluminator化學發光凝膠成像儀（美國Bio-RAD公司）。

1.3分組和模型制備大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常組對照8只（給予基礎飼料）和高脂喂養組32只。高脂飼料配方[6]：脂肪占20%，糖占10%，蛋黃粉占10%，基礎飼料占60%，能量為4 928 kcal·kg-1。所有大鼠自由攝食和飲水，飼養溫度22～24℃，濕度50%～70%，采用高脂飲食誘導肥胖（diet-induced obesity，DIO）大鼠模型，共飼養14周。肥胖判斷標準為超過正常組平均體質量的20%[7]，體質量未達到標準者予以剔除。最后將造模成功的DIO大鼠隨機分為肥胖模型組和針刺干預組，每組各8只。

1.4針刺干預選取天樞（ST25）、三陰交（SP6）、中脘（CV12/RN12）和足三里（ST36）進行針刺干預，穴位定位參照李珂等研究[8]，每天1次，每次20 min，每周連續5 d，休息2 d，共干預28 d。電針參數：0.25 mm×13 mm毫針，18 Hz的頻率，2 mA的強度。

1.5Western blot檢測Atg7蛋白質表達利多卡因腹腔麻醉大鼠后，股動脈放血處死，在冰浴中剝離腦組織后置于液氮罐保存。37℃水浴中解凍后，使用RIPA裂解液提取組織總蛋白，并測定蛋白濃度。根據所測蛋白濃度，每孔按蛋白量100 μg上樣。進行SDS-PAGE電泳：接通電源，穩定電壓在100 V，15 min，到分離膠以后將電壓調至180 V繼續電泳，當溴酚蘭染料到達凝膠底部時終止電泳。轉膜：將凝膠面與負極相連，硝酸纖維素膜與正極相連，接通電源，200 mA轉膜1～2 h。封閉：將硝酸纖維素膜放入用TBST Buffer稀釋的5%BSA液，用保鮮膜封好，搖床上輕搖2 h，轉速50～60。孵育抗體：將硝酸纖維素膜放入一抗（Atg7 1∶200）中，4℃過夜；用TBST將硝酸纖維素膜洗3次，每次5 min；將硝酸纖維素膜放入二抗（稀釋濃度1∶5000）中，室溫孵育2～3 h；TBST將硝酸纖維素膜洗3次，每次10 min；將硝酸纖維素膜平鋪到保鮮膜上，ECL顯色，放入化學發光凝膠成像儀的暗室中進行曝光。使用Quantity One軟件進行光密度測定，以GADPH為內參計算各組蛋白的相對表達量。

1.6統計方法采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。數據以均數±標準差(±s)表示，多樣本均數間比較采用One-Way ANOVA檢驗，方差齊則采用LSD檢驗，同組前后比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1電針干預前后各組大鼠體質量比較高脂喂養14周后，肥胖模型組和針刺干預組大鼠體質量均明顯升高，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），說明造模成功。電針干預4周后，針刺干預組大鼠體質量明顯降低，與同期肥胖模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；第18周時，針刺干預組大鼠體質量與電針干預14周時大鼠體質量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.2各組大鼠下丘腦Atg7蛋白質表達情況肥胖模型組大鼠下丘腦Atg7蛋白質含量明顯低于正常對照組（P＜0.05），電針干預4周后，針刺干預組大鼠下丘腦Atg7蛋白質含量升高，與肥胖模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1和圖2。

表1 針刺對大鼠體質量的影響Table 1 Effect of EA on rat body weight （±s，m/g）

表1 針刺對大鼠體質量的影響Table 1 Effect of EA on rat body weight （±s，m/g）

①P＜0.05，與同期正常對照組比較；②P＜0.05，與同期肥胖模型組比較；③P＜0.05，與第14周針刺干預組比較

第18周409.12±25.83 524.32±26.48①470.95± 26.09②③組別正常對照組肥胖模型組針刺干預組n8 8 8第14周410.92±26.47 518.00±24.63①520.37±24.16①

圖1 各組大鼠下丘腦Atg7蛋白質表達情況Figure 1 Effect of EA on Atg7 protein expression in hypothalamus of rats in the three groups

圖2 各組大鼠下丘腦Atg7蛋白質表達Figure 2 Atg7 protein expression in the hypothalamus of rats in the three groups

3 討論

針刺可通過中樞和外周機制減輕體質量。研究顯示，針刺可通過調控下丘腦AMPK信號通路活性減重[9]；針刺可減少腹型肥胖婦女內臟和肝臟脂肪含量[10]；其外周機制可能與調控脂肪組織的炎癥反應[11]、缺氧誘導因子-1α表達、上調UCP1[12]等有關。

本研究結果顯示，電針干預肥胖大鼠4周后，大鼠下丘腦Atg7蛋白質含量明顯增加。下丘腦自噬基因Atg7的下調可能與肥胖有關。本研究結果表明，高脂飲食可誘導大鼠造成肥胖狀態，DIO大鼠下丘腦內自噬指標活性被抑制。自噬是一種高度保守的自我吞噬消化，是降解細胞內受損細胞器的主要機制之一。作為對肥胖的反應，下丘腦對自噬的調控具有細胞特異性。研究[13]表明，基礎水平的自噬對維持下丘腦神經元的功能非常重要。在AgRP神經元中特異性抑制自噬，作為對饑餓的反應，生理性增加的神經遞質表達被減弱，這上調了POMC和α-MSH的表達，從而導致小鼠的瘦表型。Atg7缺失POMC神經元引起p62在神經元積聚，導致蛋白質聚集，p62蛋白可使自噬體發生泛素化的多功能蛋白質，該蛋白質的增加是細胞內發生自噬缺失的標志。POMC神經元內自噬缺失引起過度進食，能量消耗下降，體質量增加[14]。研究[4]發現，DIO小鼠下丘腦Atg7蛋白表達下降47%，下丘腦特異性Atg7敲除小鼠表現出肥胖狀態，提示Atg7在飲食誘導肥胖中發揮著重要作用。參與自噬啟動的unc-51樣自噬激酶1（unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）和unc-51樣自噬激酶2（unc-51 like autophagy activating kinase 2，ULK2）是Atg7的上游信號[15]。Atg7可激活下游的LC3和Atg5/Atg12復合物系統，從而促進自噬體的形成[16]。本研究發現，電針干預可使DIO大鼠體質量顯著降低，伴隨下丘腦自噬基因Atg7的上調，結果提示電針減輕肥胖大鼠的體質量可能與下丘腦自噬基因Atg7的上調表達有關。

本研究未對Atg7信號通路進行干預，進而觀察針刺對肥胖大鼠體質量的影響，未能明確針刺處理與Atg7蛋白質表達改變之間的因果關系。今后的實驗中將在該信號通路進行干預的基礎上，檢測Atg7及其上下游基因的變化，以進一步明確針刺減重的中樞自噬機制。

綜上，本研究結果發現高脂飲食可誘導大鼠造成肥胖狀態，DIO大鼠下丘腦內自噬水平下調，針刺干預可能通過上調下丘腦自噬基因Atg7的水平降低大鼠體質量。