新疆某牛場牛結核病的綜合診斷與病原分離鑒定

林 康，田莉莉，常塔娜，溫建新，范偉興

牛結核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)所引起的一種慢性消耗性的傳染病，可經呼吸道、消化道進行傳播，具體病理表現為組織器官形成明顯的結核結節，繼而結節中心出現干酪樣壞死或鈣化。牛結核病以肺結核多見，近年來，也有對肺外結核的研究報道[1]。由于結核病在世界各地均有發生，是較為嚴重的人獸共患病。除了會影響人畜的健康外，還能夠引起產量下降和貿易限制從而產生經濟影響[2]，OIE將其列入法定報告疫病，我國將其列為二類動物疫病。

牛結核病檢測的方法有很多，如皮內變態反應、比較變態反應、牛型PPD點眼試驗、IFN-γ試驗、ELISA抗體檢測試驗、病原的分離培養及PCR等方法[3]。目前官方公布的牛結核病的清除方法主要是基于檢疫和屠宰政策[4]，采用基于細胞介導的免疫反應的診斷試驗，如皮內變態反應試驗和INF-γ試驗[5]。我國以結核分枝桿菌PPD皮內變態反應試驗及IFN-γ試驗作為牛結核病檢測的標準。傳統的分離培養因結核分枝桿菌生長緩慢，耗費時間，不能滿足臨床診斷的需要。而以PPD皮內變態反應試驗為標準在檢測牛結核病時，由于其靈敏度高、特異性低，容易因為非致病性的分枝桿菌如禽分枝桿菌及環境中的其他分枝桿菌造成假陽性的現象，影響判定結果。依靠單一診斷方法鎖定的陽性牛在剖檢時常常找不到病變部位，為后續的采樣分菌工作帶來困難。因此，在牛結核病的診斷過程中多種檢測方法的組合使用有助于牛結核病的確診。

本試驗選擇新疆牛結核病歷史高發，且在以往的診斷過程中存在禽分枝桿菌干擾的某牛場，為鎖定陽性牛，找到病變進行分菌，綜合運用皮內變態反應、牛型PPD 點眼試驗、IFN-γ試驗、ELISA抗體檢測試驗4種免疫學方法進行了牛結核病的診斷。鎖定陽性牛后，對其撲殺、剖檢，采集病料后進行病原的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1材料 牛型 PPD、禽型 PPD、BOVIGAM牛分枝桿菌γ-干擾素ELISA檢測試劑盒、IDEXX牛分枝桿菌抗體檢測試劑盒、羅氏培養基。

1.2 檢測方法

1.2.1皮內變態反應 按照國家標準進行操作和判斷。

1.2.2牛型PPD點眼反應 進行點眼前，認真檢查待檢奶牛的雙眼，眼觀不正常的不進行點眼檢測。將2～3滴牛型PPD滴入左眼。點眼后，分別在3 h、6 h、9 h各觀察1次反應情況，必要時可在24 h后觀察點眼反應。若觀察到黃白色膿性分泌物，判定為陽性牛。

1.2.3IFN-γ試驗 采集5 mL檢測牛的抗凝全血，分別用特殊制備的牛型 PPD、禽型 PPD及PBS 3種刺激抗原對全血進行24 h的體外刺激。24 h后，收集刺激上清，按試劑盒說明書進行IFN-γ檢測。若牛型 PPD 的 OD 值-陰性抗原(PBS)的 OD 值≥0.1 且牛型 PPD 的 OD 值-禽型 PPD 的OD值≥0.1，判定為陽性牛。

1.2.4ELISA抗體檢測 采集檢測牛的全血，靜置離心后收集血清，按試劑盒說明書進行ELISA檢測。其中S/P=(樣品OD值-陰性OD平均值)/(陽性 OD 平均值-陰性 OD 平均值)，若S/P≥0.3，判定為陽性牛。

1.3剖檢與病料采集 將4種方法均判定為陽性的牛進剖檢，檢查病變組織，無菌采集病變組織置于樣品杯中。

1.4病原分離培養 分離培養前在生物安全柜中將待處理組織進行解凍，去除多余脂肪后，切碎組織，制成勻漿液。用巴氏吸管吸取適量的接種液，均勻接種在整個培養基斜面上。將培養基置于37 ℃溫箱中進行培養。接種后每過一周觀察菌落生長情況，8周后未生長的為陰性。

1.5PCR鑒定 提取核酸，用已建立的PCR方法對分離菌株進行結核桿菌群內的鑒定。

1.5.1引物的合成 根據文獻[6]中的報道，由生工合成7對引物，如表1所示。

表1 結核分枝桿菌復合群內PCR引物
Tab.1 PCR primers of MTC

PrimersPrimers sequences(5′-3′)Products length/bp16sRNAF:ACGGTGGGTACTAGGTGTGGG-TTTC543R:TCTGCGATTACTAGCGACTCC-GACTTCARv0577F:ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAG-GCAA786R:CTATTGCTGCGGTGCGGGCTT-CAAIS1561F:GCTGGGTGGGCCCTGGAATAC-GT-GAACTC943R:AACTGCTCACCCTGGCCACCA-CCATTGACTRv1510F:GTGCGCTCCACCCAAATAGTTGC1033R:TGTCGACCTGGGGCACAAATC-AGTCRv1970F:GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC1116R:CGCCGGCAGCCTCACGAAATGRv3877/8F:CGACGGGTCTGACGGCCAAAC-TCATC999R:CTTGCTCGGTGGCCGGTTTTT-CAGCRv3120F:GTCGGCGATAGACCATGAGTC-CGTCTCCAT404R:GCGAAAAGTGGGCGGATGCCA-GAATAGT

1.5.2反應體系與擴增程序 反應體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，引物各1 μL，模版DNA 1 μL，ddH2O 7 μL，反應的總體積為20 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min預變性；94 ℃ 1 min變性，64 ℃ 1 min退火，72 ℃ 1 min延伸，循環30 次；72 ℃ 10 min延伸。結束后置于4 ℃保存。

1.5.3結果判定 取5 μL 的PCR產物于1.0 %瓊脂糖凝膠中電泳后在凝膠成像儀中觀察結果，條帶根據文獻[6]按照表2進行結果判斷。

表2 結核分枝桿菌群內PCR方法的判定標準
Tab.2 Criteria for PCR in mycobacterium tuberculosis

Organism16sRNARv0577IS1561Rv1510Rv1970Rv3877/8Rv3120M. tuberculosis+++++++M. africanum subtype I++++-++M. africanum subtype II +++++++“M. canettii”++++++-M. caprae++++-+-M. bovis +++--+-M. bovis BCG+++----M. microti++-+-++MOTT +------

Note：+shows that it can amplifie the target fragmentit;-shows that it cannot.

2 結 果

2.14種方法綜合檢測結果 該牛場為結核病隔離場，755頭牛均為皮試陽性，將點眼、INF-γ試驗和ELISA抗體檢測結果均為陽性的牛判定為陽性病變牛，共26頭，如表3所示。

表3 4種檢測方法結果
Tab.3 Results of the four detection methods

Detection4 detection methodsSICTEye-drops reactionINF-γ test ELISA detectionPositivesAutopsy755755(100%)44(5.8%)352(46.6%)211(27.9%)26(3.4%)5

2.2病原分離鑒定結果 從26頭陽性牛中根據年齡，泌乳狀況等實際生產狀況從中隨機選擇5頭牛進行剖檢。剖檢的5頭牛進行編號，分別為03、08、47、94、97，剖檢后均在肺部發現明顯的結節病變，病變情況見表4。5頭牛的病料培養結果均為陽性。對陽性菌進行PCR鑒定，從左至右依次對應的引物16sRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8、Rv3120。根據判斷標準，結果均為牛分枝桿菌(圖1)。

M：100 bp DNA maker；1-7，8-14：Isolated strain(All others identical)圖1 MTC群內PCR鑒定結果Fig.1 PCR results of MTC

表4 病變結果
Tab.4 Results of lesions

No.Diseased regionLesion status03lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material08lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material47lungLesion,with nodules94lungLesion,with nodules97lungThe lesion is prominent,with nodules and ca-seous material

3 討 論

近年來，我國在牛結核病檢疫中以皮內變態反應試驗及IFN-γ試驗作為標準判定的結核陽性牛剖檢普遍出現在肺臟無法找到結核病變的情況，這可能因為其它非致病性的分枝桿菌如禽分枝桿菌及環境中的其他分枝桿菌造成假陽性的結果[7]，也可能是因為上述兩種方法均為牛結核病早期診斷方法，被撲殺的大部分牛仍處于感染早期尚未產生肉眼可見病變的階段[8]。所以本試驗使用皮內變態反應、牛型PPD 點眼試驗、IFN-γ試驗，ELISA抗體檢測4種免疫學診斷方法的組合，對新疆某奶牛場進行了牛結核病診斷，找到陽性病變牛。其中皮內變態反應、IFN-γ試驗是針對牛結核早期感染，而PPD點眼和ELISA抗體試驗是針對牛結核后期感染。在IFN-γ試驗中，755頭奶牛中有46.6%的陽性率，ELISA抗體檢測中有27.9%的陽性率，4種方法診斷結果均為陽性的牛共26頭。因條件局限，從中隨機選擇5頭牛進行剖檢，均能夠發現明顯的結核病變。以此推測，其余21頭牛剖檢后能夠發現肉眼可見的結核病變。剖檢結果證明，多種診斷方法的組合使用能提高牛結核病的診斷的準確性，檢出有病變的牛。

從26頭牛中剖檢的5頭牛主要表現為肺結核，在肺部均有明顯結節病變。其中47，94兩頭牛有結節病變，其余03，08，97三頭牛切開結節病變后有大量的干酪樣物質，已處于結核后期感染階段。每頭牛挑選具有典型病變的病料進行分菌，4周后觀察培養基表面出現黃色或白色的菌落。5份病料均分離到細菌，分菌率為100%(5/5)。

將5株菌用多重PCR的方法進行分型鑒定，擴增片段大小依次為 543 bp、786 bp、943 bp、999 bp，依據條帶大小和判斷標準，5株菌都為牛分枝桿菌。在4種方法組合的基礎上進一步確定鎖定的陽性牛為牛分枝桿菌感染。在分離到菌后，可用于牛分枝桿菌的鑒定，將其與臨床上其他重要的非致病性結核分枝桿菌分開來。

臨床診斷時，上述4種診斷方法耗時較長。如比較變態反應需3 d后觀察結果，IFN-γ試驗需要24 h的孵育時間，在臨床診斷中急需建立一種操作簡便，快速高效的診斷方法。已有研究證明牛分枝桿菌存在于感染動物的糞便及污染牛場的土壤和飲水中[9]，相較于普通PCR需要分離出病原菌，建立一種能快速有效的檢測奶樣，糞便或環境樣品的熒光定量PCR方法可以大幅度的節約時間，具有很高的實用價值，這也是未來牛結核病診斷方法研究的方向之一。

利益沖突：無