2005年和2015年結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥水平的變化

文舒安，張婷婷，霍鳳敏，尚媛媛，梁 倩，薛 毅，李云絮，王 芬，逄 宇，黃海榮

結(jié)核病是全球十大死因之一，是高于包括艾滋病在內(nèi)的傳染病的頭號(hào)殺手，2016年全球約有167萬(wàn)人死于結(jié)核病。據(jù)WHO《2016全球結(jié)核病年報(bào)》估算，我國(guó)耐多藥結(jié)核病患者數(shù)居世界第二位[1]。2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，全國(guó)總耐藥率為42.1%，耐多藥率為6.8%，廣泛耐藥率為2.1%[2]。因此，控制耐藥和耐多藥(MDR)結(jié)核病的流行已經(jīng)成為中國(guó)結(jié)核病防治工作的迫切任務(wù)。

乙胺丁醇(ethambutol，EMB)是1961年開(kāi)始應(yīng)用在結(jié)核病治療上的一種人工合成的具有廣譜抗分枝桿菌活性的一線抗結(jié)核藥物。2010年全國(guó)第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，280株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株對(duì)EMB的耐藥率為6.8%[1]，且在以往的研究表明，在我國(guó)的某些地區(qū)耐多藥結(jié)核同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)EMB耐藥的有50.5%～66.7%。因此，建立快速準(zhǔn)確的EMB耐藥檢測(cè)方法對(duì)于選擇有效的結(jié)核治療方案至關(guān)重要，而了解EMB耐藥相關(guān)基因的突變特征可為建立快速診斷方法提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 本研究的139株 MDR-TB(耐多藥結(jié)核分枝桿菌)菌株來(lái)自北京胸科醫(yī)院2005年和2015年就診患者的臨床分離株，所有菌株均經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸(PNB)抑制生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定為結(jié)核分枝桿菌。

1.2試劑儀器 藥敏試驗(yàn)所用乙胺丁醇購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司，營(yíng)養(yǎng)添加劑OADC購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)BD公司，羅氏培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)于珠海銀科公司，96孔板購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Costar公司，阿爾瑪藍(lán)(Alamar blue)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)Bio-Rad公司

1.3藥物敏感性測(cè)定 微孔板阿爾瑪藍(lán)顯色法 (micro plate alamar blue assay, MABA)藥敏試驗(yàn)：刮取羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4周左右的新鮮菌落置于磨菌瓶中研磨均勻，稀釋菌懸液并比濁至1麥?zhǔn)希僖?∶20比例用7H9培養(yǎng)基稀釋菌液。向預(yù)制含有不同濃度EMB的96孔板的每孔中加入100 μL菌液，37 ℃培養(yǎng)7～9 d，再向微孔板中加入20 μL阿爾瑪藍(lán)和50 μL 5% Tween-80的預(yù)混顯色液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察96孔板顏色變化。判定標(biāo)準(zhǔn)：藍(lán)色孔為無(wú)菌生長(zhǎng)，粉色孔為有菌生長(zhǎng)，藍(lán)色孔的最低藥物濃度記為能抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的MIC。當(dāng)MIC大于臨界藥物濃度時(shí)判斷為耐藥，反之則為敏感按照。定義EMB耐藥界定濃度為EMB≥5.0 μg/mL，當(dāng)5.0 μg/mL≤MIC≤20.0 μg/mL時(shí)，定義為低濃度耐藥；當(dāng)MIC≥40.0 μg/mL時(shí)，定義為高濃度耐藥。

1.4核酸提取 用接種環(huán)刮取菌落置于加有0.5 mL生理鹽水的EP管中，然后100 ℃水煮30 min，再13 000 r/min離心5 min，吸取上清大約500 μL存放于1.5 mL EP管中。

1.5目的基因擴(kuò)增、測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)分析 PCR擴(kuò)增采用的上下游引物分別為5′CTGACCGACGCCGTGGTGATAT3′ 和 5′TGAATGCGGCGGTAACGACG 3′。反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×Master MIX，上游引物和下游引物各0.5 μL，2 μL的DNA模板，10.5 μL去離子水。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，總計(jì)35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用BioEdit軟件與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv基因序列進(jìn)行比對(duì)

1.6PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后，進(jìn)一步送睿博興科公司測(cè)序。利用軟件DNAstar Lasergene進(jìn)行序列拼接和與embB基因標(biāo)準(zhǔn)序列的比對(duì)，分析突變位點(diǎn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，比較2005年和2015年敏感和耐藥菌株數(shù)兩組間的差異分析采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的兩樣本率比較(卡方檢驗(yàn))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PCR產(chǎn)物電泳圖 見(jiàn)圖1。

*1號(hào)孔為100 bp marker，2-4,6-8號(hào)為PCR產(chǎn)物，5號(hào)孔為空白圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR product electropherogram

2.22005年和2015年結(jié)核病患者耐藥情況之間的比較 2005年入選的63株MDR菌株對(duì)EMB耐藥的有57株，其中低耐藥菌株有40株，耐藥率合計(jì)為70.18%；高耐藥菌株有17株，耐藥率合計(jì)為29.82%。2015年入選的76株MDR菌株中對(duì)EMB耐藥的有71株,其中低耐藥菌株有57株，耐藥率合計(jì)為80.28%；高耐藥菌株有14株，耐藥率合計(jì)為19.72%。比較2005年和2015年敏感和耐藥兩組間的差異分析采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的兩樣本率比較(卡方檢驗(yàn))，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.410，P<0.05)。

2.3DNA測(cè)序結(jié)果 本研究發(fā)現(xiàn)2005年檢測(cè)的63株MDR中有43株攜帶embB突變，突變位點(diǎn)共7種分別為ebmB306、ebmB319、ebmB328、ebmB330、ebmB354、ebmB405、ebmB406，其中常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為embB306(26株，60.5%)和embB406(11株，25.6%)。2015年檢測(cè)的76株MDR中有56株攜帶embB突變，檢出位點(diǎn)共有6種ebmB297、ebmB306、ebmB319、ebmB354、ebmB405、ebmB406。

其中常見(jiàn)的突變位點(diǎn)為embB306(42株，75.0%)和embB406(6株，14.3%)。兩年一共檢測(cè)的139株MDR中有99株攜帶embB突變，占所有MDR的71.2%；未攜帶突變的有40株，占所有MDR的28.8%。其中有1株菌為雙位點(diǎn)突變，其余株菌均為單位點(diǎn)突變。此外，還發(fā)現(xiàn)了2種未被記錄入tbdreamdb MTB基因數(shù)據(jù)庫(kù)的突變位點(diǎn)，分別為embB354(圖2)和embB405(圖3)。比較2005年和2015年突變類型的差異，分析采用群組卡方檢驗(yàn)，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=9.410，P<0.05)。

圖2 embB354(GAC/GCC)位點(diǎn)突變測(cè)序圖Fig.2 embB354 (GAC/GCC) site mutation sequencing map

圖3 embB405(GAG/GAC)位點(diǎn)突變測(cè)序圖Fig.3 embB405 (GAG/GAC) site mutation sequencing map

2.42005年和2015年MDR基因突變與EMB藥敏相關(guān)性分析 本研究的MDR中耐EMB菌株攜帶embB突變的比例為71.01%，野生型為29.0%。297位點(diǎn)突變有1種突變形式，為低水平耐藥。306位點(diǎn)5種突變形式，后文詳細(xì)分析。319位點(diǎn)共有4種突變形式，均為低水平耐藥。328位點(diǎn)有2種突變形式，均為低水平耐藥。330位點(diǎn)突變有1種突變形式，為高水平耐藥。354位點(diǎn)有2種突變形式，低水平耐藥率為66.7%,高水平耐藥率為33.3%。405位點(diǎn)有2種突變形式，低水平耐藥率為50.0%,高水平耐藥率為50.0%。406位點(diǎn)有4種突變形式，主要與低水平耐藥率相關(guān)(70.6%)(見(jiàn)表1)。

embB基因不同突變類型引起不同水平的對(duì)EMB耐藥，306位點(diǎn)的突變中ATG/GTG (Met102Val) 這種突變形式所占比例最高，并且這種突變形式表現(xiàn)出對(duì)EMB低水平耐藥，耐藥率為50.0%。其他的4種突變形式ATG/ATA (Met102Ile)、ATG/ATC (Met102Ile)、ATG/ATT (Met102Ile)、ATG/CTG (Met102Leu)也主要表現(xiàn)與低水平耐藥相關(guān)。

3 討 論

乙胺丁醇作用于分枝桿菌阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影響細(xì)胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-蛋白聚糖復(fù)合物的形成,引起細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[3]。因與其他一線抗結(jié)核藥有協(xié)同作用，且可延緩其他藥物耐藥性的產(chǎn)生，被普遍用于臨床治療，導(dǎo)致其耐藥率高，對(duì)比2005年和2015年數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)兩年的耐藥率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明EMB在臨床使用的普遍率。在其他研究中，MDR對(duì)EMB的耐藥率為50.5%～66.7%[4-5]。而本研究中，MDR對(duì)EMB的耐藥率為92.1%(128/139)，可能與我院是結(jié)核病專科醫(yī)院，所收治的大多為反復(fù)治療的病人，其耐藥水平普遍偏高有關(guān)。其他國(guó)家如波蘭，檢測(cè)MDR中對(duì)EMB的耐藥率為34.0%(17/50)[6]，低于我國(guó)水平。因此，我國(guó)的MDR患者確定用藥方案前可先檢測(cè)其embB基因突變情況。當(dāng)MTB對(duì)EMB產(chǎn)生低濃度耐藥時(shí)，可以通過(guò)提高藥物的劑量以達(dá)到治療的目的，對(duì)于高水平耐藥的患者，可考慮換用其他藥物治療。

表1embB不同突變類型與EMB耐藥水平的關(guān)系
Tab.1 Relationship between different types ofembBmutations and EMB resistance

突變位點(diǎn)堿基替換氨基酸改變樣本數(shù)不同MIC(μg/mL)對(duì)應(yīng)的樣本數(shù)0.6251.252.55102040≥80embB297TCG→GCGSer→Ala100010000embB306ATG→GTGMet→Val440005121719ATG→ATAMet→Ile1700064304ATG→ATCMet→Ile300020001ATG→ATTMet→Ile200011000ATG→CTGMet→Leu200011000embB319TAT→GATTyr→Asp100010000TAT→TGTTyr→Cys200002000TAT→TCTTyr→Ser100001000TAT→AATTyr→Asn100010000embB328GAT→GGTAsp→Gly100000100GAT→TATAsp→Tyr100000100embB330TTC→GTCPhe→Val100000010embB354①GAC→GCCAsp→Ala300010101GAC→AACAsp→Asn100000001embB405①GAG→GACGlu→Asp200001001embB406GGC→GCCGly→Ala800015011GGC→GACGly→Asp600120003GGC→TGCGly→Cys100001000GGC→AGCGly→Ser200010100突變型合計(jì)--99001232823321野生型--40037106707合計(jì)--139038333430328

①未被記錄入tbdreamdb MTB基因數(shù)據(jù)庫(kù)的突變位點(diǎn)。

注：(1)其中一株菌為306位點(diǎn)和354位點(diǎn)的雙突變，歸類至306突變中；(2)Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸

還有大量研究MDR和embB基因突變的數(shù)據(jù)，一篇研究河南結(jié)核病embB基因突變的研究中報(bào)道MDR中攜帶embB基因突變的比率為86.2% (119/138)[7]；另一篇報(bào)道深圳市MDR中攜帶embB基因突變的比率為82.4%(42/51)[4]，也與之相似。本研究的MDR中耐EMB菌株攜帶embB突變的比例為71.01%，略低于河南和深圳，可能是由于本研究還納入了2005年的63株MDR，2005年MDR中攜帶embB基因突變的比率為68.3%(43/63)。對(duì)比其他國(guó)家，一篇研究波蘭MDR的文章中報(bào)道了對(duì)EMB耐藥的MDR中攜帶embB突變的比率為76.5%(13/17)[6]，導(dǎo)致上述差異可能是由于embB基因的突變存在地區(qū)性差異。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)EMB敏感的菌株也可以發(fā)生embB基因突變，有一株MIC為2.5 μg/mL的菌株在embB406位點(diǎn)發(fā)生了突變。其他研究也有報(bào)道[7-8]。還有些報(bào)道描述了對(duì)EMB敏感的菌株在embB的306位點(diǎn)有突變[9-10]。有2個(gè)對(duì)EMB敏感的分離株中embB306位密碼子存在突變的解釋：推薦用于藥物敏感性試驗(yàn)的EMB濃度取決用于敏感性測(cè)試的表型方法，其范圍為2～7.5 μg/mL(EMB)；可能由于這類embB306位密碼子存在突變的分離株的MIC接近EMB耐藥的界定濃度。推測(cè)在406位密碼子存在突變的原因與之相類似。

本研究發(fā)現(xiàn)了2種未被記錄入tbdreamdb MTB基因數(shù)據(jù)庫(kù)的突變位點(diǎn)embB354和embB405。其中第354位發(fā)現(xiàn)有天冬氨酸突變?yōu)楸彼岷吞於０愤@兩種突變形式，以天冬氨酸突變?yōu)楸彼嵴急榷?75%)，3株菌株中2株為低水平耐藥，1株為高水平耐藥。天冬氨酸為極性帶負(fù)電荷的氨基酸，而丙氨酸為非極性氨基酸，因此兩種氨基酸存在較大的差異，導(dǎo)致EMB靶標(biāo)embB結(jié)構(gòu)的顯著改變，從而影響了MIC。此外，這2種突變位點(diǎn)在其他研究中也有相關(guān)報(bào)道[11-12]，提示需要根據(jù)新報(bào)道的文獻(xiàn)對(duì)tbdreamdb MTB基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行更新調(diào)整。

利益沖突：無(wú)