表達LTB乳酸桿菌提高艱難梭菌類毒素疫苗黏膜免疫效應的研究

蘇 露，張雅青，顧巧玲，傅思武

熱敏性腸毒素(Heat labile enterotoxin, LT)是產(chǎn)毒素型大腸埃希菌(Entero toxigenicEscherichiacoli, ETEC)分泌的不耐熱腸毒素，具有很強的免疫原性，能夠輔助其他抗原通過黏膜免疫途徑使機體產(chǎn)生特異性抗體，常被作為黏膜免疫佐劑[1]。艱難梭菌(Clostridiumdifficile，C.difficile)是一種革蘭陽性厭氧芽胞桿菌，為機會致病菌。當腸道環(huán)境遭到破壞，艱難梭菌可引起人和家畜致病，導致腹瀉，嚴重者發(fā)展為偽膜性腸炎[2]。艱難梭菌最主要致病毒素為A毒素(C.difficileA Toxin，TcdA)和B毒素(C.difficileB Toxin，TcdB)，由于二者能誘導機體產(chǎn)生中和抗體，因此TcdA和TcdB被作為艱難梭菌疫苗研究重要的候選抗原。本研究通過構建LTB佐劑乳酸桿菌表達載體，并以TcdA和TcdBA的類毒素作為疫苗抗原，觀察乳酸桿菌表達LT佐劑的免疫保護效應。

1 材料與方法

1.1實驗菌株和實驗動物 大腸埃希菌DH5α、產(chǎn)毒素型大腸埃希菌CICC10665株、艱難梭菌標準株VPI10463、乳酸桿菌CGMCC1.557株和質(zhì)粒pSIP411(本實驗室保存)。SPF級BALB/c雌性小鼠(購自蘭州大學動物實驗中心)，168只，18～20 g。

1.2乳酸桿菌LT表達載體的制備 從產(chǎn)腸毒素型大腸埃希菌CICC10665株中克隆LTB亞單位(Heat labile enterotoxin B subunit，LTB)基因，并與大腸埃希菌-乳酸桿菌穿梭表達載體pSIP411 進行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，提取質(zhì)粒，酶切、PCR擴增和測序(華大生物科技有限公司)。制備乳酸桿菌感受態(tài)，將pSIP411-LTB電轉(zhuǎn)化到乳酸桿菌中，通過質(zhì)粒提取、雙酶切鑒定和 PCR鑒定篩選出的陽性菌，進行Spp IP誘導表達；提取表達細菌總蛋白，SDS-PAGE電泳，切下目的基因蛋白條帶，轉(zhuǎn)模，通過Westernblot檢測LTB在乳酸桿菌中的表達(一抗為兔抗LTB的血清，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG)，通過增強化學發(fā)光法進行顯影和定量檢測。將表達LTB的乳酸桿菌陽性克隆接種液體培養(yǎng)基中，37 ℃，24 h后，菌液稀釋至1010CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3艱難梭菌TcdA和Tcd B類毒素的制備 艱難梭菌置于透析袋中產(chǎn)毒培養(yǎng)；產(chǎn)毒培養(yǎng)液經(jīng)低溫離心及除菌，硫酸銨鹽析，濃縮透析后經(jīng)第一次酸沉淀；通過陰離子交換層析后，進行第2次酸沉淀。獲得純化的艱難梭菌TcdA和Tcd B，加入甲醛溶液至終濃度為0.4%，37 ℃放置7～14 d脫毒，最終制品即為艱難梭菌TcdA和Tcd B的類毒素。

1.4動物分組及疫苗方案 疫苗A組、疫苗 B組、疫苗A +LT組、疫苗B+LT組、空白組和對照組，各組均為28只小鼠。疫苗A、B組分別在第0 d、第14 d和第28 d時小鼠皮下分別接種TcdA類毒素與TcdB類毒素(各5 μg)；疫苗A+LT、疫苗B+LT組在第0 d、第14 d和第28 d分別接種類毒素A與類毒素B(各5 μg)，并同時灌胃表達LTB乳酸桿菌培養(yǎng)液(每次連續(xù)3 d，0.2 mL/d)；對照組和空白組在第0 d、第14 d和第28 d時皮下接種PBS并灌胃生理鹽水，同時對照組灌胃乳酸桿菌培養(yǎng)液(每次連續(xù)3 d，0.2 mL/d)。

1.5動物攻毒 在小鼠第1次接種后34 d后，各疫苗組和對照組小鼠均灌胃艱難梭菌VPI10463培養(yǎng)液106CFU；空白組給予灌胃生理鹽水。觀察小鼠腹瀉、及死亡情況，并計算5 d體重減輕量=攻毒前體重-攻毒后第5 d體重。

1.6檢測血清IgG及糞便IgA 各疫苗組和空白組小鼠在初次接種0 d、10 d、24 d和38 d后，分別收集小鼠血清和糞便，采用ELISA方法檢測小鼠艱難梭菌TcdA和TcdB抗體血清IgG和糞便IgA滴度(上海仁捷生物科技有限公司)。96孔板用純化的艱難梭菌TcdA和TcdB包被，加小鼠血清，37 ℃孵育1 h，洗板后加HRP 標記的兔抗鼠IgG(血清)二抗，37 ℃孵育1 h，洗板后加ELISA 底物反應液，37 ℃孵育30 min。終止反應。在酶標儀上于 450 nm 處測各孔吸光度值。

1.7采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1重組載體pSIP411-LTB的鑒定 如圖1所示，重組質(zhì)粒pSIP411-LTB經(jīng)EcoRI與BamHI雙酶切后，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中，得到一條長約390 bp與目的基因LTB相同的片段。基因測序結果在Blast數(shù)據(jù)庫進行序列比對，驗證為LTB相同序列。

M：Mark；1：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌PCP擴增產(chǎn)物；2：pSIP411-LTB 質(zhì)粒PCP擴增產(chǎn)物；3：經(jīng)EcoRI與BamHI雙酶切的pSIP411-LTB片段；4：pSIP411-LTB 質(zhì)粒圖1 重組質(zhì)粒pSIP411-LTB雙酶切和PCP擴增產(chǎn)物Fig.1 Recombinant plasmid pSIP411-LTB bienzyme digestion and PCP amplification products

2.2LTB在乳酸桿菌中的表達 將乳酸桿菌，pSIP411-乳酸桿菌，pSIP411-LTB-乳酸桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希菌超聲處理，進行SDS-PAGE蛋白電泳，將目的蛋白LTB經(jīng)Westernblot檢測，pSIP411-LTB-乳酸桿菌和ETEC均在約30 kDa處出現(xiàn)1條共同的條帶，而乳酸桿菌和pSIP411-乳酸桿菌沒有(圖2)。

1：乳酸桿菌；2：pSIP411-乳酸桿菌；3：pSIP411-LTB-乳酸桿菌；4：ETEC圖2 Westblot檢測乳酸桿菌LTB的表達Fig.2 Westblot assay for expressing of Lactobacillus LTB

2.3艱難梭菌感染小鼠 密切觀察感染艱難梭菌后的各組老鼠死亡率、腹瀉和體重變化情況。在表1中，對照組小鼠腹瀉發(fā)病率為100%，死亡率42.86%；而空白組、各疫苗組小鼠均無腹瀉和死亡現(xiàn)象。與空白組和各疫苗組比較，對照組小鼠的5 d體重下降明顯，有統(tǒng)計學意義(F=14.034，P<0.01)。

表1 各組小鼠感染艱難梭菌感染后的臨床表現(xiàn)
Tab.1 Clinical manifestations ofC.difficileinfection in mice of each group

組別腹瀉率/%5日體重下降量/g死亡率/%空白組0-0.76±0.13?0對照組1000.83±0.1142.86疫苗A組0-0.64±0.07?0疫苗A+LT組0-0.77±0.07?0疫苗B組0-0.61±0.06?0疫苗B+LT組0-0.65±0.08?0

注：*P<0.001，與對照組比較。

2.4免疫保護效應 各組在初次接種后0 d抗TcdA和Tcd B血清IgG和糞便IgA沒有統(tǒng)計學意義(F=0.688，1.3491；P均≥0.05)。初次接種10 d、24 d和38 d 后，與空白組和對照組比較，各疫苗組抗毒素血清IgG和糞便IgA顯著升高，有統(tǒng)計學意義(F=284.928，1 037.052，696.822，74.004，184.065，166.952；P均<0.01)；與疫苗A組比較，疫苗A+LTB組抗Tcd A血清IgG和糞便IgA顯著升高，有統(tǒng)計學意義(F=21.878，27.222，8.310，56.490，63.759，101.780；P均<0.05)；與疫苗B組比較，疫苗B+LTB組抗Tcd B血清IgG和糞便IgA也顯著升高，有統(tǒng)計學意義(F=45.243，20.594，45.002，14.296，6.682，10.452；P均<0.05)。與空白組比較，對照組在第38 d時抗毒素血清IgG和糞便IgA升高，有統(tǒng)計學意義(F=647.730，205.148；P均<0.01)(圖3)。

3 討 論

艱難梭菌為人體常見的機會致病菌，當宿主免疫力下降或腸道發(fā)生菌群失調(diào)時，導致宿主出現(xiàn)腹瀉、發(fā)熱、惡心、腹痛和食欲不振等癥狀。艱難梭菌能夠產(chǎn)生芽孢并隨人或動物糞便進入環(huán)境中，存活時間長，很容易經(jīng)口感染人類或動物[3]。艱難梭菌也是院內(nèi)感染引起腹瀉常見的病原體之一[4]。對于

*P<0.01，與空白組比較，有統(tǒng)計學意義；#P<0.05，與疫苗A或B組比較，有統(tǒng)計學意義圖3 各組抗TcdA和Tcd B血清IgG和糞便IgA的比較Fig.3 Comparison of anti-TcdA and Tcd B serum IgG and fecal IgA in each group

艱難梭菌感染的預防，飲食衛(wèi)生和手部衛(wèi)生尤為重要；疫苗預防艱難梭菌的感染是一個重要的途徑[5]。本實驗結果顯示艱難梭菌攻毒組小鼠全部發(fā)生腹瀉和體重減輕(5 d)，死亡率為42.86%；說明艱難梭菌有毒株的致病力還是比較強的。

目前艱難梭菌疫苗主要是以TcdA和Tcd B作為靶抗原的疫苗[6]，此外還有難梭菌疫苗的鞭毛帽蛋白、表面多糖和脂磷壁酸等作為疫苗的候選抗原[7-9]。艱難梭菌TcdA和TcdB是艱難梭菌重要的致病物質(zhì)，由一個19.6 kb的染色體區(qū)域編碼。雖然世界各地已分離的艱難梭菌毒素種類差異比較大，但絕大多數(shù)致病性的艱難梭菌都同時表達TcdA和TcdB，由于其能誘導機體產(chǎn)生中和抗體，被作為艱難梭菌主要的疫苗候選抗原[10]。本實驗選用TcdA和TcdB類毒素作為候選疫苗，結果顯示各疫苗組在感染艱難梭菌后，并沒有出現(xiàn)明顯的腹瀉和體重減輕現(xiàn)象，也無小鼠死亡現(xiàn)象，說明疫苗對艱難梭菌感染的預防還是很有效果的；同時TcdA和TcdB類毒素能誘導小鼠產(chǎn)生強烈的IgG和IgA的應答，這與Broecker等人的研究結果相同[11]。

疫苗佐劑能夠有效地改變和提高宿主對抗原的特異性應答。疫苗佐劑包括傳統(tǒng)佐劑如鋁佐劑、油乳佐劑，新型佐劑如微生物來源佐劑、微粒抗原遞送體系、多糖佐劑、皰疹病毒VP22蛋白佐劑和天然來源佐劑等[12]。LT屬于微生物來源佐劑，其是產(chǎn)毒素型大腸埃希菌的代謝產(chǎn)物，具有強烈的免疫原性，誘導機體產(chǎn)生強烈的黏膜免疫效應[1]。LT由A、B兩個亞單位構成，由于LTA毒性強，常需要突變后作為候選佐劑，而LTB不具有毒性并具有良好的佐劑效應被直接選用候選佐劑，由于LTB能夠與靶細胞GM1神經(jīng)節(jié)苷脂結合的功能常作為抗原載體, 與抗原聯(lián)合時, 其佐劑作用加強了所連接的細胞對抗原的攝取[13-14]，因此本研究采用LTB作為佐劑來增強艱難梭菌類毒素的疫苗免疫效應。

對于艱難梭菌的感染，腸道黏膜免疫起著至關重要的作用。近年通過使用腸道正常菌群乳酸桿菌、雙歧桿菌等作為腸道感染疫苗轉(zhuǎn)基因載體的研究越來越多[15]。通過口服活的表達載體，在腸道持續(xù)的表達疫苗蛋白或佐劑，有利于黏膜免疫的產(chǎn)生，對于腸道感染的病原體疫苗更具有優(yōu)勢。本實驗結果顯示，聯(lián)用佐劑LTB疫苗組的血清IgG和糞便IgA滴度在初次接種10 d后均明顯高于單用疫苗組，說明乳酸桿菌載體在腸道表達LTB，能夠增強宿主的黏膜免疫效應，增強艱難梭菌疫苗的免疫應答。對照組口服乳酸桿菌后，在初次接種0 d，10 d，24 d后，血清IgG和糞便IgA滴度與空白組比較，無統(tǒng)計學差異，說明乳酸桿菌并不能單獨增強小鼠的免疫；在初次接種34 d時口服感染艱難梭菌，對照組小鼠出現(xiàn)體重減輕和死亡，且活下來的小鼠血清IgG和糞便IgA滴度較空白組明顯升高，說明艱難梭菌誘導小鼠免疫應答，體液免疫反應增強。

本研究探索乳酸桿菌表達佐劑聯(lián)合艱難梭菌類毒素疫苗對小鼠進行免疫效應的研究，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌LTB表達載體對艱難梭菌疫苗具有很好的佐劑效應，為進一步研制艱難梭菌LTB-TcdA-乳酸桿菌載體活疫苗打下基礎。

利益沖突：無