微小隱孢子蟲IId亞型早期感染對(duì)HCT-8細(xì)胞TLRs的影響

王臣榮，張振杰，張 璐，張貴玲，牛子文，張龍現(xiàn)，張素梅

隱孢子蟲是重要的人獸共患原蟲之一，可致感染宿主以腹瀉為主要臨床癥狀的隱孢子蟲病[1-2]。隱孢子蟲多通過“糞-口”途徑傳播，牛被認(rèn)為是人類隱孢子蟲病的重要傳染源，牛糞污染水源和食物是導(dǎo)致人體隱孢子蟲病暴發(fā)的主要因素[3-5]。寄生于牛的隱孢子蟲主要有4種：微小隱孢子蟲(C.parvum)、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)、牛隱孢子蟲(C.bovis)和芮氏隱孢子蟲(C.ryanae)[6]。而C.parvum是最重要的人獸共患隱孢子蟲蟲種，世界范圍內(nèi)人體隱孢子蟲病例約45%由該蟲引起，而其它3個(gè)寄生于牛的蟲種均具有宿主特異性[1,7]。犢牛感染的C.parvum蟲亞型常見的屬IIa亞型家族，多見于北美洲、南美洲、歐洲和澳洲等國家和地區(qū)，而在北非、中亞和東亞等國家和地區(qū)，則以IId亞型家族更為常見[7-12]。目前在中國動(dòng)物和人中分離出的C.parvum均為IId亞型[8]。

C.parvum是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲，其致病能力與宿主的免疫狀況相關(guān)[13]。TLRs (Toll-like receptors, TLRs)是一種常見的病原模式識(shí)別受體，其在病原體入侵宿主細(xì)胞期間起著非常重要的作用。一旦病原分子被TLRs識(shí)別，這些模式受體招募接頭蛋白，激活下游信號(hào)進(jìn)一步分泌粘附分子、炎癥因子(細(xì)胞因子或者趨化因子)和抗菌肽來抵抗C.parvum的感染[14-15]。C.parvumIIa亞型早期感染對(duì)人膽管上皮細(xì)胞及結(jié)腸腺癌細(xì)胞TLRs的影響已被研究[16-17]，結(jié)果顯示C.parvum感染導(dǎo)致人膽管上皮細(xì)胞TLR4的上調(diào)是通過let-7i的下調(diào)導(dǎo)致的，但是作為中國流行株的C.parvumIId亞型感染對(duì)人腸上皮細(xì)胞TLRs的影響尚未見報(bào)道，而本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表數(shù)據(jù)顯示C.parvumIId亞型感染會(huì)導(dǎo)致人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜發(fā)生改變[18]。因此本研究利用qPCR分析C.parvumIId亞型早期感染(4 h和12 h)對(duì)HCT-8細(xì)胞TLRs的影響，并利用生物信息學(xué)分析這些表達(dá)差異顯著的miRNAs與TLRs的關(guān)系，為C.parvum感染腸道上皮細(xì)胞機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自索萊寶科技有限公司；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自四季青公司；TRIzol購自Invitrogen公司；TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒及SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)試劑盒都購自索萊寶科技有限公司。

1.2試驗(yàn)細(xì)胞及蟲株 HCT-8細(xì)胞及C.parvumIId亞型卵囊均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3C.parvumIId亞型卵囊無菌化處理 向卵囊加入適量滅菌雙蒸水和10%次氯酸鈉溶液，保證次氯酸鈉終濃度為2.5%，后渦旋振蕩，4 ℃靜置10 min，5 000 r/min，離心10 min，反復(fù)洗滌3次，棄上清，將沉淀置入DMEM培養(yǎng)基中，用于感染HCT-8細(xì)胞。另取部分無菌化C.parvum卵囊，100 ℃水浴5 min，使C.parvum卵囊活性喪失，喪失活性的卵囊作為陰性對(duì)照組。

1.4HCT-8細(xì)胞的培養(yǎng)及感染 參考朱惠麗等[19]建立的C.parvum感染HCT-8細(xì)胞的方法，將狀態(tài)良好的HCT-8細(xì)胞消化，加入適量含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，向六孔板中加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)基，37 ℃, 5% CO2培養(yǎng)。待HCT-8細(xì)胞貼壁70%～80 %時(shí)，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以無菌PBS洗滌2次，試驗(yàn)組每孔加入2 mL 2% FBS 及100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，其中含有1×107個(gè)無菌化C.parvum卵囊，對(duì)照組加入等量喪失活性的C.parvum卵囊，2.5 h后，棄去6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基，添加2 mL 2% FBS 及100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在4 h及12 h后分別棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以無菌PBS洗滌2次后向六孔板加入1 mL Trizol，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞裂解，室溫靜止5 min，放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.5細(xì)胞RNA的提取 在-80 ℃超低溫冰箱中取出加Trizol的HCT-8細(xì)胞，溶解并震蕩，后加入200 L氯仿，震蕩混勻，室溫靜置5 min。12 000 r/min，離心15 min，完全吸取上清于1.5 mL離心管，勿吸入白色蛋白層后加入500 L異丙醇，輕輕搖勻，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min，離心10 min，棄上清。向沉淀中加入1 000 L用DEPC水配置的75%乙醇。8 000 r/min，離心10 min，棄上清，重復(fù)2次。置于超凈臺(tái)6～8 min后向沉淀中加入20 L DEPC水。

1.6RNA濃度、純度和完整性鑒定 利用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測出RNA的A260/A280和A260/A230。利用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，利用28S RNA與18S RNA條帶寬度評(píng)價(jià)RNA的完整性。

1.7qPCR分析TLRs表達(dá)情況 參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，采用qPCR檢測10種TLR mRNA表達(dá)量，PCR引物見表1。

1.8生物信息學(xué)分析表達(dá)差異顯著miRNAs和TLRs的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表數(shù)據(jù)顯示C.parvumIId亞型感染會(huì)導(dǎo)致人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜發(fā)生改變[18]，這些表達(dá)差異顯著的miRNAs包括hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3591-3p、hsa-miR-6074、hsa-miR-454-5p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-4685-3p、hsa-miR-1908-3p、hsa-miR-942-5p、hsa-miR-5580-3p、hsa-miR-6763-5p、hsa-miR-181d-3p、hsa-miR-18b-3p、hsa-miR-4689、hsa-miR-1256、hsa-miR-3976、hsa-let-7b-3p、hsa-miR-6721-5p、hsa-miR-3118、hsa-miR-3121-5p及hsa-miR-1287-3p，利用Target Scan Human 7.2和 miRDB分別預(yù)測差異表達(dá)的miRNAs靶基因，并取其交集，進(jìn)一步分析差異表達(dá)的miRNAs與TLRs的關(guān)系。

表1 TLRs及GAPDH引物
Tab.1 Details of primers of TLRs and GAPDH

TLRs引物上游引物下游引物TLR1GGTGTTGGCTGTGACT-GTGATGGAGTTCTTCTAAGGG-TATGTLR2GATGCCTACTGGGTG-GAGAAGACGGAAATGG-GAGAAGTTLR3CCAAGCCT-TCAACGACTGTTGCGTGTTTCCAGAGCCTLR4GGTGATTGTTGTGGT-GTCCCAAGTGTTCCTGCT-GAGAAGGCGTLR5CAACCTTACAGCGAACCAAACATCCCAACAGAGCTLR6CAGTTAATACTT-TAGGGTGCTCGTTTCTATGTGGTT-GAGGGTLR7CCTTTCCCAGAGCATA-CAGCGGACAGAACTCCCA-CAGAGCTLR8CAGAGCATCAAC-CAAAGCAAGCTGCCGTAGCCT-CAAATACTLR9GTGCAGCCGGAGAT-GTTTCGTGAATGAGTGCTCGT-GGTAGTLR10GCCCACCACAATCTCT-TCCAGCCCACATTTACGC-CTATCCTTGAPDHAGAAGGCTGGGGCT-CATTTGAGGGGCCATCCA-CAGTCTTC

1.9數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及分析 采用2-△△Ct方法對(duì)處理數(shù)據(jù)，并利用GraphPad Prism 8對(duì)處理的數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1RNA純度及完整性鑒定 提取RNA的A260/A280比值范圍為1.9～2.07，A260/A230比值范圍為2.0～2.2。經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳后，可以顯示28S RNA與18S RNA條帶寬度約為2∶1，5S RNA條帶模糊(圖1)。

1-2：RNA from 4 h post infection; 3-4: RNA from 12 h post infection; 5: RNA from uninfection HCT-8圖1 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Picture of formaldehyde denatured agarose gel electrophoresis

2.2HCT-8細(xì)胞中TLRs的表達(dá) 提取HCT-8細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增TLR1～10基因片段其電泳圖(圖2)。對(duì)擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行測序及比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增出的10個(gè)片段確為TLR1～10 mRNA特異性片段。

M：DL 2000；1-10：TLR1-10；11：GAPDH圖2 TLR1～10及GAPDH瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of TLR1-10 and GAPDH

2.3C.parvumIId亞型早期感染(4 h和12 h)對(duì)HCT-8細(xì)胞TLRs的影響 采用2Ct方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，在C.parvumIId亞型感染HCT-8細(xì)胞4 h和12 h，只有TLR2和TLR4上調(diào)，其中感染4 h TLR2較對(duì)照組上調(diào)3倍(t=4.961,P=0.0077)，TLR4較對(duì)照組上調(diào)3倍(t=22.31,P<0.0001)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；感染12 h TLR2較對(duì)照組上調(diào)1.5倍(t=4.052,P=0.004 1)，TLR4較對(duì)照組上調(diào)1倍(t=12.18,P=0.000 3)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其余TLRs在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯變化，其中感染4 h TLR1(t=0.8941,P=0.421 8)，TLR3(t=0.666 7,P=0.541 5)，TLR5(t=0.500 1,P=0.643 3)，TLR6(t=1.013,P=0.368 5)，TLR7(t=1.578,P=0.157 8)，TLR8(t=2.115,P=0.101 9)，TLR9(t=0.159 6,P=0.880 9)及TLR10(t=2.032,P=0.112 0)；感染12 h TLR1(t=1.983,P=0.118 3)，TLR3(t=0.337 1,P=0.753 0)，TLR5(t=0.616 7,P=0.570 8)，TLR6(t=0.606 4,P=0.577 0)，TLR7(t=1.158,P=0.311 4)，TLR8(t=2.305,P=0.082 5)，TLR9(t=0.135 6,P=0.898 0)及TLR10(t=2.485,P=0.067 8)，結(jié)果見圖3和4。

圖3 微小隱孢子蟲IId亞型感染4 h對(duì)HCT-8細(xì)胞TLRs轉(zhuǎn)錄的影響Fig.3 Transcription of TLRs in HCT-8 cells at 4 hours after C. parvum infection

圖4 微小隱孢子蟲IId亞型感染12 h對(duì)HCT-8細(xì)胞TLRs轉(zhuǎn)錄的影響Fig.4 Transcription of TLRs in HCT-8 cells at 12 hours after C. parvum infection

表2 TLR信號(hào)通路中miRNAs的預(yù)測靶基因
Tab.2 Predicted target genes of miRNAs in TLR signaling pathways

miRNA靶基因TLR信號(hào)通路中靶基因功能miR-34b-5pSPP1促進(jìn)IFNα和IFNβ分泌miR-454-5pAKT3激活NF-ΚB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌MAPK1促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌miR-3591-3pCD80誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生 MAP2K3促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌MAP2K4促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌MAP3K7激活NF-κB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌RIPK1激活NF-κB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌TAB2激活NF-κB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌miR-4685-3pMAP2K6促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌RIPK1激活NF-κB,IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌miR-942-5pCHUK促進(jìn)IFNα和IFNβ分泌MAPK10促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌TLR6結(jié)合TLR2識(shí)別糖脂及酵母多糖PIK3CD激活NF-ΚB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌TAB2激活NF-κB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌miR-18b-3pPIK3R1激活NF-ΚB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌miR-3976JUN促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌miR-1256RAC1激活NF-κB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌TAB2激活NF-κB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌miR-1287-3pCXCL11T淋巴細(xì)胞移行感染部位MAPK13促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌表2(續(xù))miRNA靶基因TLR信號(hào)通路中靶基因功能miR-3121-5pTLR3識(shí)別dsDNATLR8識(shí)別ssDNAmiR-6721-5pAKT2激活NF-ΚB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌PIK3R2激活NF-ΚB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌MAPK3促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌RELA激活NF-ΚB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌TRAF3促進(jìn)CD40、CD80、CD86、IFNα、IFNβ和趨化因子的分泌let-7b-3pMAP3K8促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌MAP2K3促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌AKT2激活NF-ΚB,促進(jìn)IL-12、IL-1β、IL-6和TNFα的分泌

3 討 論

研究報(bào)道C.parvumIIa亞型卵囊感染的人膽管上皮細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞均表達(dá)TLR1～TLR10 mRNA，并且TLR2和TLR4 mRNA被顯著上調(diào)[16-17]，與本研究C.parvumIId亞型早期感染致HCT-8細(xì)胞TLR2和TLR4 mRNA顯著上調(diào)一致，說明C.parvum早期感染人膽管上皮細(xì)胞和人小腸上皮細(xì)胞都會(huì)引起其TLR2和TLR4 mRNA的顯著上調(diào)，TLR2和TLR4的顯著上調(diào)可能與細(xì)胞識(shí)別C.parvum有關(guān)。研究報(bào)道C.parvumIIa亞型卵囊早期感染致人膽管上皮細(xì)胞TLR2和TLR4的上調(diào)，導(dǎo)致其下游的IL-1R相關(guān)激酶、p-38和NF-kB活化進(jìn)而來抵抗C.parvum的感染[16]。

關(guān)于感染C.parvum的宿主miRNAs介導(dǎo)TLRs的表達(dá)研究并不多，Chen等[20]報(bào)道微小隱孢子蟲IIa亞型卵囊感染導(dǎo)致人膽管上皮細(xì)胞let-7i下調(diào)，let-7i在轉(zhuǎn)錄后水平抑制TLR4的表達(dá)，下調(diào)的let-7i可以導(dǎo)致TLR4蛋白表達(dá)水平提高，進(jìn)而來調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞對(duì)微小隱孢子蟲的免疫反應(yīng)。而本研究通過預(yù)測表達(dá)差異顯著miRNA的靶基因，發(fā)現(xiàn)這些預(yù)測的靶基因中沒有TLR2和TLR4，但是這些靶基因中有TLR信號(hào)通路相關(guān)的基因。由于本研究未在蛋白水平上對(duì)TLR1～10進(jìn)行分析，因此下一步應(yīng)對(duì)TLR1～10蛋白作進(jìn)一步分析，結(jié)合表達(dá)差異顯著的miRNAs，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNAs與TLR信號(hào)通路間的調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，C.parvumIId亞型早期感染致HCT-8細(xì)胞TLR2和TLR4 mRNA顯著上調(diào)，而TLR2和TLR4的顯著上調(diào)可能在C.parvum感染腸道上皮細(xì)胞方面起到一定的作用。通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)miRNAs的預(yù)測靶向中有TLR信號(hào)通路相關(guān)基因。

利益沖突：無