放射誘導旁觀者效應的研究進展

龔玉華，徐中葉

江蘇省無錫市人民醫院 （江蘇無錫 214023）

自倫琴發現X射線至今，電離輻射已經廣泛運用于臨床疾病的診斷和治療，其中的放射治療發展尤為迅猛。人們曾經認為電離射線穿過細胞核引起的直接或間接的DNA損傷是產生放射治療生物學效應的唯一原因[1]。1992年，Nagasawa和Little發現在單層培養的細胞中，少于1%的細胞的細胞核被單束α射線穿透，出現姐妹染色體交換頻率增加的細胞卻超過30%[2]。這一發現激發了研究者們對放射誘導的所謂“旁觀者效應”的興趣，一系列與之相關的研究隨之開展。利用高線性能量傳遞（LET）射線如α射線、重粒子，或者低LET射線如X射線、γ射線，針對不同細胞分別進行的體外或體內實驗證實了旁觀者效應的存在[3-4]，并初步探討了其發生機制。然而，該效應的確切機制目前尚不清楚。本研究對近十年內提出的放射誘導的旁觀者效應（radio induced bystander effects,RIBE）發生機制及其常用研究方法進行綜述。

1 研究方法

放射誘導的旁觀者效應中存在兩類細胞，即“作用細胞”（受照射的細胞）與“反應細胞”（旁觀者細胞），前者受照射后產生信號分子通過細胞間連接結構傳遞或釋放到細胞外圍環境中，后者接收這些信號并產生與前者相類似的輻射損傷誘導的應激反應，如誘導基因表達、基因突變、微核形成、誘導分化、凋亡、惡性轉化等[5]。在諸如X射線、γ射線、重粒子等輻射中，目前使用高LET的α射線，特別是以精確的微束形式甚至特定的粒子數目照射一定的區域、單個細胞或者亞細胞結構[6-7]的方法最為常見。有研究者將“作用細胞”與“反應細胞”共同單層培養或三圍聚集培養，旨在保證兩者間的物理接觸以便于讓細胞間的縫隙連接發揮傳遞信息的作用（gap junctiongmediated intercellular communication，GJIC）。相反，有研究側重于探討由“作用細胞”釋放入培養基環境中的信號，常在同一培養基中以稀疏集落培養上述兩類細胞，或者收集受照射的“作用細胞”周圍介質來培養“反應細胞”，即所謂的共培養轉移實驗（cocuhure/media transfer experiments）[8]。

2 DNA損傷現象

旁觀者細胞的DNA損傷在旁觀者效應的發生中有著重要的作用，與受照射細胞一樣，其DNA可能發生的損傷在類型和分布上都相當復雜，目前已被識別的有20多種，包括堿基突變、DNA單鏈斷裂（SSB）、雙鏈斷裂（DSB）以及共價結合所導致的DNA-蛋白質交聯、DNA-DNA交聯等。在受到直接照射的“作用細胞”中，因DNA雙鏈斷裂引起的染色體異常占主導，而“反應細胞”的染色體異常則多因堿基損傷或是單鏈斷裂所致[9]。研究者們常通過觀察微核形成（MN）、姐妹染色體交換（SCE）及使用γH2AX foci技術等作為DNA、染色體損傷的證據[10]。Kashino等[11-12]利用共培養轉移實驗，將接受過1 Gy常規X射線照射的3種中國倉鼠卵巢細胞（CHO）（包括野生型、缺乏SSB修復能力和缺乏DSB修復能力）的培養基質分別轉移給缺乏DSB修復能力的xrs5細胞，培養后發現3個樣本中xrs5細胞發生MN的程度并無差異。然而，將受X射線照射過的CHO細胞的基質轉移到另一培養基中，在這一培養基中同時培養具有DNA修復能力的CHO及不具有DSB修復能力的xrs5細胞，利用克隆形成分析兩者，結果發現xrs5細胞對可能存在的“旁觀者信號”的敏感程度明顯高于CHO。綜合以上實驗，Kashino等[11-12]提出接收旁觀者信號的細胞的DNA修復能力決定了旁觀者細胞的復雜應答反應，而非產生這些信號的細胞的DNA修復能力。

旁觀者細胞產生DNA損傷影響細胞的功能與存活，是旁觀者效應中最關鍵的環節之一。有研究認為這與旁觀者細胞活性氧簇的形成、線粒體功能和線粒體依賴的信號通路以及鈣離子的流動[13]有關，其具體機制仍然是一個研究熱點。

3 涉及機制

3.1 活性氧簇、線粒體和核因子-кB

活性氧簇（ROS）是一類化學性質極活潑的物質，在正常人體內通過氧代謝產生，對細胞、組織具有一定的損傷作用。研究發現經放射線照射后的細胞ROS增多，另有大量證據表明ROS與旁觀者效應的發生密切相關，但是ROS極不穩定的特性決定了其作用時限和范圍的局限性，如羥自由基的存在時間和彌散能力均是以納秒、納米來計的，這些都提示ROS的作用可能是通過調節信號通路來實現的[14]。Shao等[15]在照射T98G細胞引起AG01522細胞旁觀者效應的研究中發現ROS的產生還與NO，TGF-β1有關。Chen等[16]利用共培養轉移實驗，將rho（+）細胞和 rho（-）細胞照射10 min后的基質分別轉移給旁觀者細胞培養基，結果發現照射rho（+）細胞得到的基質引起旁觀者細胞ROS增加了35%，明顯高于另一組，而通過觀察γH2AX foci發現ROS增加明顯的旁觀者細胞DNA損傷較另一組嚴重的多，另外，ROS清除劑DMSO處理后的細胞DNA損傷明顯減輕。該實驗一方面證實了活性氧簇在旁觀者效應中發揮著巨大作用，另一方面提示了旁觀者細胞ROS的量以及DNA損傷程度與受照射細胞的線粒體DNA功能存在一定的聯系。研究發現缺乏線粒體DNA的人皮膚纖維母細胞無論作為受照射細胞還是旁觀者細胞，其所得到的旁觀者效應強度均不如野生型，這一點更加證實了線粒體功能的重要性。利用Bay11抑制核因子-кB活性、PTIO清除NO或通過抑制鈣離子的攝取從而抑制iNOS都能增強旁觀者細胞的DNA穩定性，減少突變發生的頻率[17-18]。

根據以上分析，一條依賴于線粒體功能，有活性氧簇參與，以iNOS、NO、核因子-кB為主線的旁觀者效應的調節機制呈現在眼前，這為進一步探究更精確的機制提供了思路。

3.2 可溶性因子擴散與MAPK通路

研究表明，受照射后的細胞可能釋放一些可溶性因子，這些因子一方面形成了細胞周圍的炎癥微環境，另一方面可能與未照射的臨近細胞接觸，引發旁觀者效應，這可能是RIBE發生的重要機制之一。已經被實驗證實存在的可溶性因子包括TGF-β1[14]、白介素-6、白介素-8[19]、轉化生長因子-α（TGF-α）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。有證據顯示白介素-8、TGF-α、TNF-α和TGF-β1可以與旁觀者細胞上的相應受體結合，激活旁觀者細胞的MAPK信號通路家族[9]。MAPK信號通路家族包括ERK、JNK和p38，以上的分泌因子激活這些通路，并進一步通過核因子-кB、AP1和ATF-2等影響旁觀者細胞的生存能力和基因突變，從而表現出旁觀者效應。Coates等[20]發現巨噬細胞的應答反應在受照射后炎癥微環境的形成和引發基因型依賴的旁觀者效應中發揮著重要作用。針對可溶性因子及受體和MAPK通路的深入研究或許將使掌控旁觀者效應成為可能。

3.3 GJIC的作用

縫隙連接（GJ）又稱融合膜，散在分布于相鄰細胞間，是動物細胞中最普遍存在的一種細胞連接。它由6個柱狀蛋白質亞基組成，這些亞基環形排列形成通道樣結構連接相鄰細胞的質膜。這種通道結構可以允許分子量低于1500的水溶性分子直接通過，通道在pH值降低或鈣離子濃度升高時會變小甚至關閉，以保護臨近細胞不受影響[21]。目前大量證據表明GJIC參與了旁觀者效應的發生[2,9]。為研究縫隙連接對于旁觀者效應的作用，大部分實驗都選用以α射線照射單層培養的細胞中的一小部分，通過觀察非照射部分的應答反應進行判斷。Shao等[22]嘗試使用重粒子（碳粒子束）照射單層培養的人纖維母細胞，發現照射劑量越低，發生微核形成的數目卻在增加，并且這種對低劑量照射的敏感性隨著GJIC增強劑8-Br-cAMP的使用而增強，相反，GJIC的抑制劑林丹則可明顯減弱基因的毒性反應。然而，允許通過縫隙連接的分子種類繁多，可以是核苷酸、多肽或者第二信使等，具體是何種分子的傳遞引發了旁觀者效應有待進一步的研究揭示。

4 總結與展望

經過數十年的研究，人們對旁觀者效應的認識正在日漸加深。根據旁觀者效應已知的一些特點可以推測，它對腫瘤的放射治療有著重大的建設性作用：利用它對未照射細胞的影響，可以減少照射劑量，縮小照射范圍而達到相同的治療效果；阻斷它對鄰近正常組織的效應則可以起到保護正常組織、提升放射治療靶向特異性的作用。相信隨著研究的繼續深入，對放射誘導旁觀者效應的機制認識將更加透徹，并最終可以將其應用到放射治療和防護的實際工作中。