高溫大曲中一株產香細菌的篩選及香氣成分分析

周陽子， 邊名鴻， 劉文藝， 蔣佳靜， 許文靜

(四川輕化工大學生物工程學院， 四川 自貢 643000)

引 言

醬香型白酒是中國白酒四大基本香型之一，在醬香型白酒生產中醬香物質主要來源于高溫大曲，其形成與微生物的代謝活動及美拉德反應有密切聯系[1]。高溫大曲發酵時間長，中后期品溫高達60 ℃以上，獨特的制曲工藝形成了特殊的微生物區系[2]。在高溫大曲中主要以細菌居多，霉菌次之，酵母菌最少，有研究說高溫大曲是一種“細菌曲”[3-4]。細菌作為醬香型白酒釀造過程中最重要的一類微生物，對增強醬香型白酒風味、提高質量起著重要作用，一直以來都是研究的重點與熱點。信春暉等[5]曾報道過嗜熱芽孢桿菌是產生醬香風味和芝麻香風味的主要菌種。姜鵬[6]等將三株產香突出細菌優化后添加至大曲中，大曲的質量有所改善，白酒出酒率、原酒總酸和總酯均有所提高。TANG[7]等使用高通量測序研究茅臺和國臺大曲細菌的多樣性，其細菌豐富度不同但細菌菌落組成是基本一致。對高溫大曲中細菌的研究，有利于揭示醬香的形成機制。

本文從高溫大曲中篩選出產香細菌，對其進行了耐受性試驗，并通過固態發酵試驗研究了該菌的揮發性風味產物及對醬香的貢獻，為產醬香微生物的挖掘及應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

高溫大曲樣品，取自赤水河畔的名優酒廠。大米、小麥、麩皮：均為市售。

1.1.2 培養基

營養瓊脂培養基(g/100 mL)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，瓊脂2.0。

細菌液體培養基(g/100 mL)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0.5。

高粱小麥固體發酵培養基：小麥與高粱質量比為1:1，小麥全部粉碎，高粱部分粉碎；加入50%的水浸潤。

1.2 產香細菌的篩選

1.2.1 產香細菌的分離

稱取5g粉碎均勻的大曲，放入裝有95 mL生理鹽水和少數玻璃珠的250 mL錐形瓶中，置于搖床振蕩30 min，得到大曲浸出液。將大曲浸出液作十倍梯度稀釋，取稀釋倍數為10-4、10-5、10-6、10-7的稀釋液0.1 mL直接涂布于營養瓊脂培養基上，分別采用常溫法(37 ℃的恒溫培養1～2 d)和高溫法(50 ℃的恒溫培養1～2 d)兩種方法進行篩選，將長勢良好且菌落形態有較大差異的細菌，劃線純化后在4 ℃下斜面保存備用。

1.2.2 產香細菌的復篩

取初篩菌株接種于細菌液體培養基中，37 ℃搖床培養24 h即為細菌種子液。將細菌種子液按照10%的接種量添加至高粱小麥固體發酵培養基中，按照35 ℃→40 ℃→45 ℃→50 ℃→55 ℃進行梯度升溫，每培養24 h升溫5 ℃，共培養5 d。對照組操作一致，但不接入細菌種子液。固態發酵完成后，將從酸味、醬味和異味等三個方面對菌株固態發酵產物進行嗅聞感官評價，篩選出整體香氣協調，特征香味突出的菌株進行接下來的實驗。

1.2.3 菌種的鑒定

菌株形態及生理生化鑒定：對純化后單菌落的形態、顏色、大小進行觀察。對菌種進行革蘭氏反應、V.P.反應、7%NaCl 耐鹽生長、厭氧生長、淀粉水解等一系列試驗，并參照《伯杰細菌鑒定手冊》加以對比鑒定。

16S rRNA序列同源性分析鑒定：按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作進行基因組DNA的提取，并以27F和1492R為引物進行PCR擴增，將擴增產物送上海生工股份有限公司測序。將測序結果在NCBI中進行BLAST比對，利用MEGA6.0軟件建樹，并進行系統發育學分析。

1.2.4 產香細菌的生長特性研究

(1)生長曲線的測定：將分離篩選出的產香細菌接種于細菌液體培養基中，于37 ℃，160 r/min搖床培養，每隔2 h取1次樣，空白對照為不接種的細菌液體培養基，于600 nm處測其OD值。

(2)耐受特性分析

以OD600為指標，在原有細菌液體培養基的基礎上，分別考察溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃)，pH值(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5)，酒精濃度(v/v)(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%)，NaCl濃度(m/v)(5%、8%、11%、14%、17%、20%、23%、26%)、葡萄糖濃度(m/v)(0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)5個因素對細菌生長情況的影響，恒溫搖床培養24 h測定數據。

1.2.5 產香細菌固態發酵風味成分分析

采用頂空固相微萃取-氣質聯用分析檢測固態發酵產物揮發性風味物質。準確稱取菌株固態發酵后的發酵產物樣品2 g，裝入5 mL頂空樣品瓶中，加入50 μL濃度為20 mg/100 mL的乙酸丁酯內標。平衡條件：溫度設為55 ℃，平衡時間為20 min，萃取時間為50 min。GC-MS分析條件設定按照參考文獻[8]。將檢測結構與數據庫中質譜信息進行比對，確定揮發性風味成分，根據內標和各揮發性成分的峰面積數據，按峰面積歸一化法[9]計算出樣品中各揮發性風味物質的相對含量。

2 結果與討論

2.1 產香細菌的篩選

2.1.1 產香細菌的分離純化

通過稀釋涂布分離法，采用常溫法、高溫法兩種方法，對曲樣進行平板菌落分離，從高溫大曲中共分離得到23株菌落形態上有較大差異的菌株，菌落形態描述見表1。

2.1.2 產香細菌復篩

將分離純化的23株菌株活化后，在無菌條件下接種于液體培養基中，37 ℃振蕩培養1 d，再按10%的接種量將其接種于高粱小麥固體培養基中，35 ℃→55 ℃梯度升溫，每培養24 h升5 ℃，共靜置培養5 d，根據感官評定，從中篩選出醬香風味濃郁的菌株進行GC-MS分析，固態發酵產物感官評定見表2。

表1 不同細菌菌落形態描述

由表2可以看出，不同的細菌在相同條件下固態發酵后呈現不同的感官。未接入細菌的對照組沒有一點醬味，只有一點點酸味和異味，由于小麥和高粱在蒸煮后又經過高溫烘焙，本身存在一定的香氣，但并未產生醬香味。大多數細菌高溫固態發酵后產生醬味，但有些細菌不僅沒有醬味，還產生了強烈的異味，如XJ-8、XJ-17。XJ-12、XJ-15、XJ-16產醬香味大也有較大的酸味，沒有異味， 這可能是由于高溫大曲中的細菌在發酵過程中會產生一定的酸，同時酸也是醬香型白酒的一大特征。經感官初步評定，篩選醬味較強，異味較小的XJ-12進一步試驗。

2.1.3 細菌XJ-12的鑒定

對XJ-12進行形態學觀察、生理生化、分子鑒定，由圖1可知，菌落成不規則圓形，顏色為白色，邊緣不整齊，表面濕潤，鏡檢形態為革蘭氏陽性菌。生理生化試驗結果見表3，菌株在55 ℃下能生長，7%NaCl環境中能生長，兼性厭氧，試驗結果與《伯杰細菌鑒定手冊》中地衣芽孢桿菌的生理生化特性基本一致[10]。

表2 產香細菌固態發酵的感官評定

注：表中數字代表氣味強度，從0到10逐漸增強，0為最弱，10為最強。

圖1 細菌菌落形態和顯微形態圖

表3 細菌生理生化實驗

注: + : 陽性反應; - : 陰性反應。

由圖2可知，XJ-12和地衣芽孢桿菌聚為一類，結合菌株形態、生理生化試驗，初步鑒定XJ-12菌株為地衣芽孢桿菌，登錄號為MK859992。在高溫大曲的制作過程中，由于溫度的升高，氧氣含量相對減少，地衣芽孢桿菌等耐高溫、兼性厭氧的芽孢桿菌成為了高溫大曲中的優勢菌群[11]。

圖2 細菌的系統發育樹

2.2 產香細菌的生長特性研究

(1)菌株生長曲線的測定

由圖3可知，該細菌生長較為迅速，培養4 h后逐漸進入對數期，18 h時OD600達到最大，此后菌株生長較為平緩，進入穩定期。

圖3 細菌的生長曲線

(2)耐受特性分析

①耐溫性試驗

高溫制曲發酵過程中，網羅富集了優勢微生物，同時形成相應的香味物質[14]，研究菌株對溫度的耐受性，有助于篩選嗜溫微生物并合理有效地將其應用到釀酒生產實踐中。由圖4可知，菌株能在30 ℃～40 ℃之間能較好地生長，且在55 ℃左右也能生長，耐溫性較好。

圖4 不同溫度對細菌生長的影響

②耐酸試驗

由于發酵環境為酸性環境，發酵產酸快，pH較低，因此對釀酒微生物耐酸性要求較高，同時pH能改變微生物細胞中的電解質，從而對微生物的生長代謝造成一定影響[15]。由圖5可知，菌株在pH值大于4時均能較好生長。當pH值小于3.5，其生長量明顯降低。

圖5 不同pH值對細菌生長的影響

③耐酒精試驗

酒精對細胞的抑制作用比較復雜，重點體現在它能夠抑制細菌的存活和增殖[16]。圖6可知，初始乙醇濃度越高，OD值越小，當乙醇濃度在10%以上時，該菌的生長受到明顯抑制，對菌株生長的影響差異不顯著(P>0.05)，幾乎不生長，該菌的最大耐酒精濃度為8%。

圖6 不同酒精濃度對細菌生長的影響

④耐鹽試驗

由圖7可知，該菌株耐鹽能力較好，能在14%的NaCl濃度中生長，在8%的NaCl濃度中OD值達到最大，菌株此時生長情況最好；在當鹽濃度高于17%時，對菌株生長的影響差異不顯著(P>0.05)，菌株生長受到抑制[17]。

圖7 不同NaCl濃度對細菌生長的影響

⑤耐糖度試驗

由圖8可知，初始糖濃度越高，OD值越小。當初始糖濃度達到 30%時，該菌幾乎不生長，對菌株生長的影響差異不顯著(P>0.05)。高濃度的糖通過影響細胞的滲透性對細菌生長繁殖產生抑制，該菌的最高耐糖度為25%，具有較好的耐受性。

圖8 不同糖度對細菌的影響

2.3 產香細菌固態發酵風味成分分析

將XJ-12進行固態發酵后，采用頂空固相微萃取法檢測固態發酵產物揮發性風味物質的含量，結果見表4。XJ-12固態發酵產物揮發性成分共有39種，主要有2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯酚、苯乙醇、辛酸乙酯、乙偶姻、愈創木酚、正己酸乙酯，這些揮發性成分是組成醬香風味的重要物質。而有些成分則是固態發酵后特有的，如2,4,5,6-四氨基嘧啶33、2-癸酮、2-甲基丁酸-2-苯乙酯、異丁酸乙酯、異戊醇等，在已有的研究中，這些成分在醬香型白酒中均有檢測到[18]。

表4 XJ-12固態發酵產物揮發性風味成分

由表4可知，XJ-12菌株固態發酵產物揮發性成分中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高，占總含量的15.96%，苯酚、苯乙醇等芳香族化合物含量較多，同時還有較高的乙偶姻和異戊酸、正丁醇。丁酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異丁酯等酯類化合物，占總含量的23.95%。在已有的高溫大曲產香細菌的研究中，其代謝產物以四甲基吡嗪為主要特性化合物，同時具有較高的乙偶姻，本研究中產香細菌XJ-12產吡嗪能力較強，這與相關研究相符合[19]。除此以外，XJ-12產生的酯類化合物也較為豐富，在白酒風味形成中，這些酯類物質也起著關鍵性作用。

3 結束語

本研究通過稀釋涂布分離法，采用常溫法、高溫法兩種方法從高溫大曲中共分離得到23株菌落形態上有較大差異的菌株。通過感官嗅聞法，篩選得到XJ-12醬香最為突出，經過形態學觀察、生理生化、分子鑒定初步鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌。研究了該菌的生長耐受性，發現該菌生長較為迅速，對溫度、鹽及糖度都有較好的耐受性。通過固態發酵發現地衣芽孢桿菌揮發性產物主要有2,3,5,6-四甲基吡嗪、乙偶姻、苯乙醇、苯酚、苯乙酸乙酯等，其中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高，占總含量的15.96%，同時酯類物質含量也較為豐富。該地衣芽孢桿菌具有很好的耐受能力與產醬香能力，具有較好的開發潛力和應用價值。