ADAM28反義寡核苷酸對人牙齦成纖維細胞內ADAM28的基因表達的影響

趙 征 李 杰 丁秀娜 周 磊 孫德剛

先天性牙根發育不良（congenital hypoplasia of tooth root，CHTR）是外胚層發育不良在牙齒發育中的一種表現，是牙根生理性發育障礙、牙根代謝功能紊亂的一種疾病，與牙源性間充質細胞的增殖和分化異常密切相關，乳、恒牙列均可發生，同時牙冠發育和牙齒萌出都無異常[1]。

金屬蛋白酶解離素28（a disintegrin and metalloproteinase 28，ADAM28）是我們課題組應用改良消減雜交技術從臨床先天性牙根發育不良（CHTR）患者的差異表達基因中篩選出來的可能致病基因之一，其與牙齒、牙根發育異常有密切的相關性，是定位于細胞表面擁有蛋白水解和黏附特性的跨膜分泌型糖蛋白[2]。ADAM28表達于多種牙源性細胞，其中人牙齦成纖維細胞（human gingival fibroblasts，HGFs）具有活躍的自我更新能力，并有合成和降解膠原纖維的功能。

與牙周組織再生密切相關的細胞群被認為是來源于牙周韌帶的細胞，但這類細胞來源少、不易取材。HGFs向人牙根面趨動附著、定向生長是其重要功能之一，在牙周組織的生理改建和病理修復過程中具有重要意義。牙齦成纖維細胞（GF）的位置鄰近牙周組織缺損區，來源豐富，易獲得，具有很強的增殖能力，通過基因治療不僅可能成為誘導牙周組織再生的一種理想的靶細胞，還可以釋放生長因子使其成為組織再生中有效的生長因子緩釋體系[3]。HGFs具有多向分化潛能，在體外一定條件下能被誘導向成骨、成軟骨和成脂分化[4]；可在體外誘導礦化[5]，且表現出更高的再生潛能，起到抗炎及免疫調節的作用[6]，這為牙周再生中種子細胞的來源提供了一種潛在的可能性。本文設計合成ADAM28反義寡核苷酸（AS-ODN）轉染HGFs，旨在阻斷細胞內ADAM28基因的表達，為基因治療CHTR疾病提供可行性依據。

資料和方法

1.主要試劑和儀器：ADAM28的多克隆抗體（santa cruz，USA），脂 質 體Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA），FITC標記的羊抗兔IgG、DAPI核染料、抗人波形絲蛋白單克隆抗體（Vimentin，Dako，USA），抗人細胞角蛋白單克隆抗體（Cytokeratin，Dako，USA），Western blot試劑盒（武漢博士德公司），CO2細胞培養箱（NuAire，USA），垂直蛋白電泳儀、轉移電泳儀（Bio-Rad公司），體視顯微鏡、倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、數碼照相系統（Olympus，Japan），一般化學試劑均為國產分析純。

2.ADAM28反義寡核苷酸的設計與合成：按照參考文獻[7]所示步驟進行。

3.HGFs的分離、培養與鑒定

（1）組織塊法原代培養及傳代：本研究經青島市口腔醫院人類研究倫理委員會審核批準后實施。牙齦組織取材于青島市口腔醫院口腔外科門診因正畸需要拔除的健康前磨牙的新鮮健康齦乳頭組織，患者年齡12～36歲，在患者簽署知情同意書后切取牙齦組織。具體步驟見參考文獻[7]，取第3代（P3）細胞用于以下實驗。

（2）細胞形態學觀察及來源鑒定：①形態學觀察：倒置相差顯微鏡下觀察原代及傳代后細胞生長狀態。②免疫學鑒定：細胞傳至第3代，制成3×106/cm2的細胞懸液，制備細胞爬片。按參考文獻[7]所示的免疫熒光染色步驟分別檢測vimentin和cytokeratin（分別1∶200稀釋）的表達，用激光共聚焦顯微鏡及數碼照相系統觀察拍照。

4.免疫熒光檢測轉染效率：利用Lipofectamine 2000介導進行瞬時轉染，核酸轉染濃度為40μmol/L。實驗分3組：ADAM28 AS-ODN組，ADAM28 S-ODN組，未轉染組（只接種細胞，不轉染）；具體步驟按照參考文獻[8]施行。轉染48h后觀測轉染效率，轉染效率＝同一視野內的發熒光細胞數/倒置相差顯微鏡下同一視野內的細胞總數。胰酶消化收集各組細胞，PBS充分洗滌，4℃離心后收集細胞，備作RT-PCR、Western blot檢測。

5.檢測封閉效率：①RT-PCR檢測：按照參考文獻[8]所示步驟施行。②Western blot檢測：按照參考文獻[8]步驟進行。

6.統計學分析：采用SPSS21.0軟件包對數據進行統計學分析。實驗數據以±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析的SNK檢驗；P＜0.05為具有顯著性差異。

圖1 HGFs的形態學觀察及來源鑒定

結 果

1.細胞原代及傳代培養：原代細胞（P0）生長約6d，單層鋪滿瓶底95%用0.25%胰蛋白酶消化傳代，應用差速消化法分離HGFs和上皮源性細胞，傳代后HGFs貼壁良好，形態規則，細胞呈漩渦狀、柵欄狀、放射狀排列。取第3代（P3）HGFs用于實驗。

2.細胞鑒定：①形態學鑒定：倒置顯微鏡下，原代及傳代生長的細胞呈長梭形或星形成纖維樣細胞，核呈圓形或橢圓形，有長短不同的胞質突，胞質多顆粒物質，胞質均勻，核圓，核仁清晰；傳代后的細胞呈放射狀走行，排列緊密（圖1A）。②免疫學鑒定：Vimentin在HGFs胞質、胞膜中呈現綠色熒光的陽性表達，胞核經DAPI染成藍色（圖1B）；Cytokeratin在HGFs胞質中表達陰性，胞核經DAPI染成藍色熒光（圖1C），符合成纖維樣細胞的特征，說明HGFs來源于中胚層間充質，且無上皮源性細胞混雜，陰性對照組均未見陽性染色結果。

3.轉染效率檢測結果：轉染48h，2組HGFs的形態、生長特性與轉染前無差異，少數細胞懸浮死亡，貼壁細胞數維持在3×104/cm3。激光共聚焦顯微鏡下，2組均可見細胞胞質發出較強的綠色熒光（圖2），AS-ODN組、S-ODN組的轉染效率分別為92%和87%，轉染效率無顯著差異。

4.RT-PCR檢測結果：各組對應的GAPDH（900bp）條帶亮度基本一致，AS-ODN組的ADAM28（255bp）條帶亮度較另2組明顯減弱（圖3），圖像分析結果顯示：AS-ODN組、S-ODN組、未轉染組RT-PCR條帶的相對灰度值分別為0.24±0.02、1.06±0.07、0.75±0.03，且AS-ODN組與后2組分別比較，P均＜0.01（*），具有顯著性差異。S-ODN組與其他2組分別比較，P＜0.01（+），具有顯著性差異。在轉錄和翻譯水平證明應用的AS-ODN對ADAM28的表達具有良好的封閉效果。

圖2 轉染效率的檢測結果（FITC/DAPI熒光標記，激光共聚焦顯微鏡，×200）

圖3 RT-PCR檢測

5.Western blot檢測結果

三組均在35.3kDa處出現雜交條帶，AS-ODN組ADAM28的蛋白表達條帶較另2組明顯減弱（圖4），圖像分析顯示：AS-ODN組、S-ODN組、未轉染組Western blot條帶的相對灰度值分別為0.21±0.02、0.95±0.08、0.55±0.02，AS-ODN組與后2組分別比較，P均＜0.01（*），差異顯著。S-ODN組與其他2組分別比較，P＜0.01（+），具有顯著性差異。在蛋白水平證明ADAM28反義寡核苷酸可有效抑制HGFs內ADAM28蛋白的轉錄表達。

圖4 Western blot檢測

討 論

牙齒發育是一個眾多基因通過各種信號通路、達到調控目的的復雜生物學過程，其核心是牙胚形態發生和組織細胞分化。牙根發育是牙齒發育后期的重要環節，其中有許多生長因子、細胞膜表面成分和細胞外基質蛋白參與。研究牙根發育特異性啟動信號分子系統的基因組功能，已成為當今口腔發育生物學的一個研究熱點。

CHTR疾病目前在國內外尚無有效的治療方法，其病因仍不清楚，近年來我們一直在探索基因治療CHTR疾病的有效途徑。越來越多的研究顯示：ADAM28基因在多種疾病如乳腺癌[9]、B細胞-急性淋巴細胞白血病[10]、頭頸部鱗狀細胞癌[11]和致命的急性呼吸道感染[12]的發病機理中均發揮關鍵作用。近年的研究證實：人ADAM28是人TNF-α的一種異常脫落酶，是涉及代謝紊亂綜合征發病機理的主要促炎癥細胞因子之一[13]。ADAM28的金屬蛋白酶域和解離素域能夠促進炎癥反應并最終導致代謝功能紊亂[14]，而ADAM28金屬蛋白酶域的主要基底物包含胰島素樣生長因子結合蛋白-3（insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），分別導致脂肪形成和炎癥反應[14，15]。據此推斷，治療性阻斷ADAM28能夠降低HGFs炎癥反應的發生率，減低CHTR發病率，均由于減弱的IGFBP-3裂解和TNF-α脫落所致，推測ADAM28在CHTR疾病進程中可能發揮著關鍵作用，接下來我們可嘗試開展將ADAM28 AS-ODN應用于治療CHTR疾病的動物模型，以觀察治療效果。

反義寡核苷酸封閉基因表達是基因治療方法之一。天然反義RNA是一類分子質量較小的多聚寡核苷酸，它們與生物體雙鏈DNA的正義鏈或mRNA的前體序列互補結合，滲入到基因組特異區域，形成三股螺旋DNA或環狀DNA從而阻斷目的基因的轉錄翻譯[16，17]。反義抑制策略為在下頜形態發生、早期牙齒發育和牙根形成中抑制基因的表達提供了一種具體有效的方法[18]。

反義寡核苷酸的功能發揮很大程度上取決于它的穩定性，提高穩定性的普遍有效方法是進行化學修飾[19]。經過化學修飾的AS-ODNs，可延長半衰期、增加穩定性、利于功能發揮[20]。常用硫代修飾，它的優點是：硫代修飾的寡核苷酸易合成，能激活RNaseH，能抵抗核酸酶的降解，能改變寡核苷酸的帶電狀態，以被動轉運方式透過細胞膜，增加組織細胞的攝取[19，20]。本研究中將ADAM28 AS-ODN和S-ODN片段進行全硫代修飾及熒光標記，確保其具有較高的特異性和穩定性；并借助脂質體Lipofectamine 2000介導成功轉染HGFs，獲得較高的轉染效率，保證了后續封閉效率的檢測。

實驗中應用RT-PCR和Western blot方法，在轉錄、翻譯和蛋白水平證實，特異性ADAM28 AS-ODN分子可有效阻斷HGFs內ADAM28蛋白的轉錄表達，成功阻斷ADAM28的活化途徑和HGFs胞質內基質蛋白的分泌，達到了預期效果，為CHTR疾病的臨床治療提供了新的依據。