蘇木乙酸乙酯對急性冠脈綜合征外周血CD4+T淋巴細胞增殖及Th17/Treg平衡的影響*

李鑫峰 周亞濱 王 倩 楊建飛△

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱 150040；3.南京中醫藥大學附屬鹽城市中醫院，江蘇 鹽城 224000）

急性冠脈綜合征（ACS）是由冠狀動脈中不穩定性的斑塊破裂、糜爛或出血后誘發冠狀動脈內血栓形成，從而引起的一系列急性、重癥心肌缺血綜合征［1］。根據其臨床類型可分為不穩定型心絞痛（UAP）、非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI）和 ST段抬高型心肌梗死（STEMI）。與以往的研究不同，目前認為動脈粥樣硬化是一類免疫炎癥性疾病，大量的炎性細胞和炎癥介質參與從脂質斑塊到粥樣斑塊的整個過程，而且炎癥反應是引起斑塊不穩定性的重要因素之一［2］。

筆者前期研究發現，蘇木乙酸乙酯提取液（SAEE）能夠顯著降低大鼠血清單核細胞趨化蛋白1、重組人巨噬細胞炎癥蛋白-1β及超敏C反應蛋白（hs-CRP）的水平，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用［3-5］。同時，SAEE還能夠調控血清T淋巴細胞亞群及細胞因子的水平，從而發揮免疫調節和抗炎的作用［6-7］。研究發現，CD4+T淋巴細胞亞群的失衡在動脈粥樣硬化炎癥調控機制方面發揮著重要的作用，同時，CD4+CD25+Fox3p+調節性T細胞能夠通過抑制低密度脂蛋白誘導的細胞活化，從而改善動脈粥樣硬化［8］。因此，本課題通過檢測外周血CD4+T淋巴細胞的增殖，白細胞介素-17A（IL-17A）、叉頭翼狀螺旋轉錄因子 3（Foxp3）的表達及Th17/Treg的比值，并以ACS和穩定型心絞痛（SAP）作為對照，進一步探討SAEE的抗動脈粥樣硬化的作用機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 1）診斷標準。ACS診斷參照2014年美國心臟協會和美國心臟病學會發布的《非ST段抬高型急性冠脈綜合征患者管理指南》［9］和2012年歐洲心臟病學會發布的 《ST段抬高型心肌梗死管理指南》［10］中相關標準和分型標準。SAP診斷參照2007年中華醫學會心血管病分會發布的 《慢性穩定型心絞痛診斷與治療指南》［11］。2）納入標準：符合上述標準；經醫院醫學倫理委員會批準；知情同意并簽署知情書。3）排除標準：同時伴有急性期腦卒中的患者；合并嚴重的肝、腎及惡性腫瘤的患者；妊娠及哺乳期女性患者；近期服用免疫抑制劑或類固醇類藥物者。

1.2 臨床資料 選取筆者所在醫院心內二科2017年1月至2018年3月收治的ACS患者30例 （包括UAP16例，NSTEMI 5例，STEMI 9例），同時選取 10例SAP患者作為陰性對照組。兩組患者臨床資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

1.3 MTT比色法檢測CD4+T淋巴細胞的增殖 兩組患者均于禁食12 h后抽取空腹靜脈血9 mL，肝素抗凝，以備檢測。采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，免疫磁珠法分離CD4+T淋巴細胞，重懸于10%小牛血清的1640培養液中，接種于培養板，設立SAP組、ACS 組、ACS+SAEE 低劑量組（40 mmol/L）和 ACS+SAEE高劑量組（80 mmol/L）。加入CD3單克隆抗體，培養4 d后，酶標儀測定各組在570 nm處的OD值。1.4 流式細胞術檢測外周血Th17及Treg的表達采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，用10%小牛血清的1640培養基制備單細胞懸液，接種于培養板，設立SAP組、ACS組、ACS+SAEE低劑量組（40 mmol/L）和 ACS+SAEE 高劑量組（80 mmol/L）共培養1 h。 37℃、5%CO2孵育6 h，PBS洗滌，加入FITCCD4抗體1 μL避光孵育60 min，加入Foxp3檢測打孔、固定濃縮液1 mL避光孵育1 h。加入IL-17A抗體和Foxp3抗體，流式細胞儀檢測IL-17A和Foxp3的百分比含量。

1.5 RT-PCR檢測IL-17A mRNA和Foxp3 mRNA的表達 采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，用10%小牛血清的1640培養基制備單細胞懸液，接種于培養板，設立SAP組、ACS組、ACS+SAEE低劑量組（40 mmol/L）和 ACS+SAEE 高劑量組（80 mmol/L）共培養1 h。Trizol一步法提取總RNA，反轉錄合成cDNA，IL-17A 上游引物：5′-GCCTTCAAGACTGAACACCG-3′。 下游引物：5′-TGACATGCCATTCCTCAGGG-3′。Foxp3 上 游 引 物 ：5′-CAGGAGAAAGCGGATACCA AATG-3′。 下游引物：5′-ATCTGTGAGGACTACCGAG CC-3′。 β-actin 上游引物：5′-TGTGATGGTGGGAATG GGTCAGAA-3′。 下游引物 5′-TGTGGTGCCAGATCTT CTCCATGT-3′。建立qPCR反轉錄體系，SYBR Green I熒光染料技術檢測IL-17A mRNA和Foxp3 mRNA的表達，以 β-actin 為內參，以 2-△△CT計算 IL-17A mRNA和Foxp3 mRNA的相對表達量。

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析，計數資料以n表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 SAEE對CD4+T淋巴細胞的增殖的影響 見表2。 ACS組外周血 CD4+T淋巴細胞 24、48、72、96 h增殖能力較SAP組顯著增高（P＜0.01）；SAEE能顯著抑制ACS外周血CD4+T淋巴細胞體外增殖能力（P＜0.05和P＜0.01），其中以SAEE高劑量組對ACS外周血CD4+T淋巴細胞體外增殖抑制效果最佳。

表2 SAEE對CD4+T淋巴細胞的增殖的影響（x±s）

2.2 SAEE對外周血Th17及Treg的表達的影響 見表3。IL-17A是Th17的代表性炎性因子，而Foxp3是Treg細胞因子分泌和細胞分化的關鍵轉錄因子，因此本研究中分別以IL-17A和Foxp3代表CD4+T淋巴細胞中Th17和Treg的水平。本研究結果顯示，ACS組Th17細胞百分比較SAP組顯著增高，Treg細胞百分比顯著降低，Th17/Treg比值顯著增高（P＜0.01）；SAEE低劑量和高劑量均能顯著降低外周血Th17細胞百分比，升高Treg細胞百分比，降低Th17/Treg的比值，與ACS組比較，差異均具有顯著統計學意義（P＜0.01）。

組 別 n Th17/CD4+（%） Treg/CD4+（%） Th17/Treg SAP組 10 ACS組 10 ACS+SAEE低劑量組 10 2.45±0.86 5.47±1.78 0.45±0.07 4.09±1.47△△ 3.12±0.97△△ 1.31±0.34△△3.46±1.23** 3.96±1.07** 0.87±0.16**ACS+SAEE高劑量組 102.74±0.91** 4.89±1.52** 0.56±0.13**

2.3 SAEE對IL-17A mRNA和Foxp3 mRNA表達的影響 見表4。與SAP組比較，ACS組患者IL-17A mRNA表達顯著增高，Foxp3 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；SAEE低劑量和高劑量均能顯著降低IL-17A mRNA的表達，升高Foxp3 mRNA的表達（P＜0.01），其中以SAEE高劑量組效果最佳。

組 別 n IL-17A mRNA Foxp3 mRNA SAP組 10 1.0 1.0 ACS 組 10 2.37±0.89△△ 0.42±0.09△△ACS+SAEE 低劑量組 10 1.76±0.48** 0.69±0.12**ACS+SAEE 高劑量組 10 1.19±0.27** 1.21±0.31**

3 討 論

心血管疾病已成為當前全球性的公共衛生問題，并且隨著生活水平的提高和飲食結構的改變，其發病率呈現逐年增高的趨勢。據2014年中國心血管病調查報告顯示，我國約有2.9億心血管疾病的患者，其中心肌梗死患者約為250萬，并且每5例死亡的患者中就有1名心血管疾病患者［12］。作為臨床上最常見的冠狀動脈粥樣硬化性心臟病類型之一，ACS是一大類包括不同臨床癥狀、預后和危險因素的臨床綜合征，具有病死率高和致殘率高的特點，嚴重危害人們的健康和生活質量［13］。據GRACE調查報告顯示，ACS患者1年死亡率約為15%，而5年死亡率甚至高達20%［14］。

既往的研究認為，進行性增大的粥樣硬化斑塊所導致的冠狀動脈管腔狹窄、阻塞是心肌缺血的常見原因。但是現在越來越多的證據表明，斑塊破裂、氧化應激損傷誘導的內皮細胞功能紊亂、炎癥反應、血小板的黏附、聚集和血栓形成是導致ACS的主要病理機制［15］。與穩定斑塊不同，不穩定斑塊的破裂易發生于富含炎性因子及細胞因子的纖維帽邊緣處。在外因的作用下，血流動力學指標發生改變，纖維帽發生破裂，脂核溢出，基質暴露，內皮下黏附分子和血小板發生聚集形成白色血栓，使管腔狹窄或不完全性閉塞，同時激活的血小板釋放活性物質，導致血管收縮，最終導致血流減少或中斷，造成心臟缺血事件的發生［16］。

近年來研究發現，免疫系統的失調在穩定斑塊到不穩定斑塊的發生、發展過程中發揮著重要的作用。免疫炎癥細胞（尤其是T淋巴細胞和巨噬細胞）的活化，能夠加速ACS局部、循環中免疫炎癥反應和分泌大量hs-CRP，促使斑塊的穩定性的改變甚至破裂［17］。CD4+T淋巴細胞在ACS炎癥反應中發揮重要的作用，有動物研究顯示CD4+T淋巴細胞能夠加速動脈粥樣硬化的發生和發展，去除CD4+T淋巴細胞能夠有效減輕小鼠動脈硬化損傷［18］。本研究結果顯示，ACS組患者CD4+T淋巴細胞增殖能力較SAP組顯著增加，而SAEE對ACS患者CD4+T淋巴細胞增殖具有顯著的抑制作用，并且以SAEE高劑量抑制作用最佳。Th17作為效應性T淋巴細胞，能夠通過分泌IL-17及TNF-α等炎性因子，激活病理性免疫炎癥反應，而Treg作為一類負性調控的免疫細胞，具有保持免疫耐受、抑制炎癥反應和維持免疫狀態平衡的作用，而Th17/Treg比例的失衡能夠促進斑塊的不穩定性和誘導ACS的發生［19］。本研究結果顯示，ACS組Th17細胞百分比較SAP組顯著增高，Treg細胞百分比顯著降低，Th17/Treg比值顯著增高，這與之前的研究結果一致［20］。SAEE能夠通過降低外周血Th17細胞百分比，升高Treg細胞百分比，降低Th17/Treg的比值，從而調控ACS患者的免疫炎癥反應。IL-17A是新發現的細胞因子，能夠加速動脈硬化的發展，Foxp3是Treg最具有特異性的轉錄因子，對Treg細胞分化、成熟及功能的發揮具有重要的意義［21］。本研究結果發現，SAEE能夠降低IL-17A mRNA的表達，升高Foxp3 mRNA的表達，從而拮抗動脈硬化的發展。

綜上所述，SAEE能夠通過抑制外周血CD4+T淋巴細胞增殖，降低IL-17A的表達，增加Foxp3 mRNA的表達，調控Th17/Treg的平衡，從而達到抑制免疫炎癥反應和拮抗動脈硬化的作用。