淫羊藿苷對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

閆 磊 梁 軍 董建將 孫曉冬 邵新然 蔡克瑞（牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

缺血性腦血管病死亡率很高，腦缺血-再灌注是其主要的病理生理過程。淫羊藿是傳統(tǒng)中藥，淫羊藿苷（ICA）是淫羊藿中的主要活性成分。ICA具有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、改善心腦血管功能、抗氧化損傷和抑制肝纖維化等功能［1-3］。本實(shí)驗通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，探索ICA對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 SPF級大鼠40只，體質(zhì)量300～400 g，雌雄不限（牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供），動物許可證號：SYXK（黑）2015-007。所有大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下，12 h明暗交替，室溫控制在20～25℃，自由攝食飲水。

1.2 試藥與儀器 淫羊藿苷（陜西西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司，批號20120516；純度98.56%），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）、髓過氧化物酶（MPO）、一氧化氮合酶（NOS）檢測試劑盒（南京建成生物工程有限公司），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 分組與造模 將大鼠隨機(jī)分成4組，即假手術(shù)組、模型組、ICA低劑量組（30 mg/kg）和ICA高劑量組（80 mg/kg），每組10只。術(shù)前給藥7 d，ICA低劑量組給予腹腔注射ICA（30 mg/kg）2 mL，ICA高劑量組給予腹腔注射ICA（80 mg/kg）2 mL，假手術(shù)組和模型組給予相同體積0.9%氯化鈉注射液，每日1次。制備腦缺血模型［4］：采用頸總動脈夾閉法。大鼠術(shù)前禁水4 h，禁食12 h，仰臥位固定后10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，取頸部正中切口，鈍性分離頸總和頸內(nèi)、外動脈，結(jié)扎頸外動脈。夾閉頸總動脈后撤掉動脈夾恢復(fù)血流后縫合。假手術(shù)組僅剝離但不夾閉頸總動脈。大鼠術(shù)后均同等條件下正常飼養(yǎng)，24 h后處死大鼠提取腦組織標(biāo)本。

1.4 觀察指標(biāo) 1） 測定腦組織 GSH-Px、SOD、MPO活性和MDA含量：將10%缺血側(cè)大鼠腦組織勻漿應(yīng)用GSH-Px、SOD、MPO、MDA試劑盒操作，測定GSHPx、SOD、MPO活性和MDA含量。測定腦組織NO含量、NOS活性［2］將 10%組織腦勻漿 4℃下離心 10 min（3 000 r/min），取上清液。應(yīng)用硝酸還原酶法測定NO含量，應(yīng)用比色法NOS活性。2）測定腦組織TNF-α的含量：將缺血側(cè)大鼠腦組織勻漿后應(yīng)用ELISA檢測試劑盒測定腦組織中TNF-α含量。3）測定血清IL-1β含量［5］：取頸靜脈血 2 mL，室溫靜置 1 h，離心 10 min（3 000 r/min），分離血清，-80 ℃保存，按 ELISA 檢測試劑盒說明書步驟操作測定血清IL-1β含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS for windows 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析統(tǒng)計學(xué)方法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間兩兩比較LDS檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦組織GSH-Px、SOD活性的比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組GSH-Px、SOD活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，ICA低劑量組和ICA高劑量組大鼠腦組織GSH-Px、SOD活性明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組大鼠腦組織 GSH-Px、SOD、MDA、MPO水平比較（x±s）

2.2 各組大鼠腦組織MDA含量、MPO活性比較 見表1。腦缺血-再灌注24 h后，與假手術(shù)組比較，模型組MDA含量、MPO活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，ICA低劑量組和ICA高劑量組大鼠腦組織MDA含量、MPO活性明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠腦組織NO、NOS、TNF-α含量比較 見表2。腦缺血-再灌注24 h后，與假手術(shù)組比較，模型組 NO、NOS、TNF-α 含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，ICA低劑量組和ICA高劑量組大鼠腦組織NO、NOS、TNF-α含量明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠腦組織NO、NOS、TNF-α和血清IL-1β含量比較（x±s）

2.4 各組大鼠血清IL-1β含量比較 見表2。腦缺血-再灌注24 h后，與假手術(shù)組比較，模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與模型組比較，ICA低劑量組和ICA高劑量組大鼠血清IL-1β含量明顯減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討 論

腦缺血-再灌注損傷是在腦缺血基礎(chǔ)上再灌注導(dǎo)致的腦組織進(jìn)一步損傷，最終會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡，其機(jī)制尚未完全明確。目前的研究表明，腦缺血-再灌注損傷主要與炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基和細(xì)胞凋亡等幾方面有關(guān)［6］。缺血組織再灌注后，氧自由基可以引起微血管和實(shí)質(zhì)器官的損傷；興奮性氨基酸、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和細(xì)胞凋亡可以對腦組織產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用；炎癥因子的釋放可以加重炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，并進(jìn)一步增加腦水腫。因此，如何抑制腦缺血-再灌注氧自由基損傷、抑制神經(jīng)毒性作用和抑制炎癥反應(yīng)是已經(jīng)成為目前腦缺血疾病方面研究的熱點(diǎn)。

淫羊藿屬于小檗科淫羊藿屬植物。《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次記載了淫羊藿具有強(qiáng)筋骨、滋補(bǔ)腎陽、祛風(fēng)濕等功效，以其干燥葉入藥，味辛、甘，性溫。ICA是傳統(tǒng)中藥淫羊藿的有效藥理成分。有研究發(fā)現(xiàn)ICA能夠上調(diào)神經(jīng)生長因子的表達(dá)，營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞，改善記憶功能［7］，因此ICA在抗神經(jīng)損傷領(lǐng)域有廣闊的研究前景［7-8］。但是其是否能在腦缺血-再灌注損傷中起到神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制尚未得到闡述。

GSH-Px和SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要抗氧化酶，其活性高低是反映機(jī)體清除氧自由基、抗氧化能力的重要指標(biāo)。SOD在全身各組織廣泛分布，SOD可以與反應(yīng)形成H2O2，H2O2經(jīng)過過氧化物酶和GSHPx的催化生成水，從而清除自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化性傷害。有研究顯示［9-11］，腦缺血-再灌注模型中，上調(diào)SOD活性可有效減輕腦缺血再灌注引起的組織損傷。MDA是不飽和脂肪酸過氧化作用的終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、壞死、細(xì)胞膜通透性增加，造成細(xì)胞損傷。MDA含量可以間接反映出細(xì)胞受自由基損害和過氧化的程度。通常將GSH-Px活性、SOD活性和MDA含量聯(lián)系起來作為評估機(jī)體清除氧自由基、抗氧化能力指標(biāo)。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)ICA可以增高腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織GSH-Px、SOD活性，減低MDA含量，增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基的能力，抑制氧自由基損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

NO是廣泛分布于神經(jīng)組織中的一種新型生物信息傳遞分子。在腦缺血再灌注損傷中，NO具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性雙重作用。機(jī)體健康狀態(tài)時NO可以通過增強(qiáng)突觸傳遞，抑制受體以及舒張血管增加腦血流量等機(jī)制起到腦神經(jīng)保護(hù)作用；但體內(nèi)NO積聚時，NO可通過損傷線粒體、鈣超載、細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)興奮性氨基酸的毒性及氧自由基損害等機(jī)制對腦組織產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，加重腦缺血損傷。NO合成的限速酶是NOS，其活性是決定NO發(fā)揮保護(hù)或損傷雙重作用的關(guān)鍵因素［4，10］。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)ICA可以減少腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織NO含量、NOS活性，抑制NO增高導(dǎo)致的神經(jīng)毒性損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷影響因素中的重要的環(huán)節(jié)［13-14］。MPO是中性粒細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，MPO的活性可以反映炎癥反應(yīng)的程度［13］。 TNF-α、IL-1β 都是主要的促炎因子［14］：TNF-α的激活在腦缺血炎癥反應(yīng)中起著核心作用。TNF-α可以介導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及炎癥遞質(zhì)等的表達(dá)，加重腦損傷［15］；IL-1β可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞及其基質(zhì)并通過內(nèi)皮進(jìn)入缺血區(qū)，通過釋放氧自由基、堵塞微血管等途徑加重腦損傷［5］。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)ICA可以減少腦缺血-再灌注損傷大鼠腦組織MPO活性、TNF-α含量和血清IL-1β含量，抑制炎癥反應(yīng)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗通過建立大鼠腦缺血-再灌注模型，發(fā)現(xiàn)ICA對大鼠腦缺血-再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與增高GSH-Px、SOD活性、降低MDA含量抑制氧自由基損傷；降低NO含量、NOS活性，抑制神經(jīng)毒性損傷；降低MPO活性、TNF-α、IL-1β含量抑制炎癥反應(yīng)損傷有關(guān)。