熱毒寧注射液對甲型流感病毒感染小鼠肺組織炎癥和相關炎癥因子水平的影響*

劉 玉 謝 緯 賈 丹 張小瑾 祝慶華 陳 生

（廣東省深圳市中醫院，廣州中醫藥大學第四臨床醫學院，廣東 深圳 518003）

流感病毒感染是上呼吸道相關疾病發病的一個重要原因，也是導致人急性肺損傷而引起死亡的主要原因之一。目前發現的流感病毒有甲、乙、丙3種類型，其中甲型流感病毒是目前導致流感感染的主要病原體。由于流感病毒抗原的變異，新的病毒株以及新的亞型不斷形成，從而使得甲型流感病毒可以反復多次突破人類的過往免疫保護進而引起流行性感冒中小型流行甚至世界性的大流行［1］。世界范圍內每年因季節性的流感導致了300～500萬人罹患流感相關的嚴重疾?。?］。據報道僅在2016年底至2017年初的不到5個月的時間里，中國有1 258名患者感染H7N9禽流感病毒，死亡率高達41%［3］。研究表明流感疫苗只是部分地起作用［2］。故此流感預防策略及治療方法顯得非常的重要，近年來越來越多的國內外學者把研究方向聚焦于流感的防治。流行性感冒屬于中醫學“時行感冒”的范疇，其主要病因為風熱毒邪外感肺衛，未得及時祛除，風熱毒邪內傳，進而內襲于肺，致使風熱毒邪蘊結肺部。其基本的病理機制為風熱外襲、熱毒蘊肺。常以辛涼解表、清熱解毒為主要治法和治則?；谘C方法的前期臨床試驗證實，熱毒寧注射液治療流感具有較好的臨床療效［4］。為了深層次地了解其作用機制，本實驗通過制備小鼠甲型流感病毒性肺損傷模型，研究熱毒寧注射液對實驗小鼠肺組織病理改變、血清及肺組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）水平的影響，以圖通過抗炎癥反應渠道初步探討熱毒寧注射液治療流感的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級的BALB/c小鼠共48只，平均體質量波動于14～17 g，由中國軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證編號：SCXK-（軍）2016-0035。飼料批號：SCXK（京）2016-0017。

1.2 病毒株 本實驗所用甲1型流感病毒鼠肺適應株FM1由廣州醫科大學呼研所病毒室提供，先由10日齡的雞胚尿囊腔進行接種培養傳代，采用微量血凝試驗進行病毒效價的滴定，其中血凝效價在1∶640以上者可供本試驗所用。在正式試驗前進行預實驗測定小鼠的病毒半數致死劑量（LD50），正式試驗采用50倍的半數致死劑量（50LD50）的病毒液。

1.3 試藥與儀器 熱毒寧注射液購自江蘇康緣藥業股份有限公司（批號1511525945）；利巴韋林注射液購自河北石家莊石藥集團歐意藥業有限公司 （國藥準字H20123033）。小鼠IL-1β ELISA試劑盒、小鼠TNF-α ELISA試劑盒、小鼠IL-6 ELISA試劑盒（欣博盛生物科技有限公司）。超凈工作臺（BCM-1300A，蘇州安泰空氣技術有限公司）；石蠟切片機（Leica RM2235）；酶標儀（Multiskan Ascent）；超低溫冰箱（BC-163D，海爾集團）；低溫高速離心機（Microfuge 22R，美國Beckman公司）；倒置顯微鏡（Nikon-TE300，Leica dmil公司）；全自動生化分析儀（7020，日本日立公司）；精密電子分析天平 （上海良平儀器儀表有限公司）；超純水器（Millpore）；微量加樣器（德國 Eppendorf公司）；一次性注射器、眼科鑷、平皿、小鼠灌胃針等。

1.4 分組與模型制備 實驗動物采用隨機數字表法將48只BALB/c小鼠按隨機數字表法分成正常對照組、模型對照組、熱毒寧注射液組、利巴韋林注射液組各12只。實驗動物進行適應性飼養3 d后稱取體質量，除正常對照組小鼠外，其余各組小鼠均制備病毒感染實驗動物模型。具體模型制備方法流程如下：首先行乙醚輕度麻醉，之后每只小鼠鼻內滴種50LD50的流感病毒液50 μL。正常對照組小鼠在同等條件下的動物房進行隔離飼養，并按上述流程鼻腔接種0.9%氯化鈉注射液 50 μL。

1.5 干預方法 各治療組在病毒接種感染后的第24小時進行給藥處理，連續給藥5 d。熱毒寧注射液組每次給予熱毒寧注射液7.2 mL/（kg·d）腹腔注射；利巴韋林注射液組每次給予利巴韋林注射液150 mg/（kg·d）腹腔注射；正常組和模型組給予同步腹腔注射0.9%氯化鈉注射液每日1 mL。各組實驗小鼠在標本采集前最后1次給藥后予禁水、禁食8 h。

1.6 標本采集與檢測 分別在造模后第3日和第5日采集標本，每次每組取6只，將實驗小鼠稱質量后，通過摘除眼球法取血，血液采集于促凝管中，立即放入低溫離心機中，4 000 r/min離心5 min，離心后取上層血清存于EP管中，放入-80℃冰箱中冷藏以備本實驗ELISA檢測。之后采取頸椎脫臼的方法將小鼠處死，在無菌操作臺上將小鼠仰臥位固定，用醫用消毒酒精將其頸部及胸腹部消毒，無菌外科剪剪開胸骨，打開胸腔，取出整個肺臟組織，立即用微量天平稱取肺組織的質量，計算各個小鼠的肺指數 （肺質量/體質量×100%）。取左側肺組織，將之放入4%的多聚甲醛固定液中進行固定，行常規脫水后石蠟包埋并進行HE染色。根據相關的參考文獻［3］進行實驗小鼠的肺組織病理學評分。剪取右肺50 mg置于EP管中，加入1 mL的0.9%氯化鈉注射液，采用組織勻漿機將肺組織進行充分地研磨，之后儲存于-80℃冰箱以備本實驗相關指標的ELISA檢測所用。采用ELISA法進行急性肺損傷實驗小鼠的血清和肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的測定。具體的檢測程序嚴格遵循ELISA試劑盒的說明書進行操作。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示。采用單因素方差分析（ONEWAY ANOVNA），組間比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠肺指數比較 見表1。模型組第3和第5日的肺指數均高于正常組（P＜0.05）。藥物治療后第3日和第5日，各治療組與模型組差異有統計學意義（P＜0.05）；治療后第5日，熱毒寧注射液組與利巴韋林注射液組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組肺指數比較（x±s）

2.2 各組小鼠肺組織病理改變觀察 見圖1。正常組：肺組織未見異常，氣管和肺泡結構清晰，管腔內無滲出物，血管無擴張充血，基本無明顯的炎性細胞浸潤。模型組：小鼠肺泡組織結構不清，部分肺泡萎陷不張，肺泡間隔明顯增寬，肺間質和肺泡內有蛋白質水腫液及大量炎癥細胞浸潤，肺微血管充血、出血、微血栓。利巴韋林注射液組：肺泡結構較模型組有改善，肺泡萎陷、充氣不良，較模型組有一定好轉，肺間隔內炎細胞滲出有一定好轉。熱毒寧注射液組：肺泡萎陷、充氣不良明顯改善，肺間質和肺泡水腫不明顯，肺泡間隔見少量纖維性滲出。

圖1 各組小鼠肺組織病理改變（HE染色，100倍）

2.3 各組小鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的比較 見表2。流感病毒感染小鼠后，模型組血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均較正常組明顯升高，且在第5日達峰值；治療后第3日和第5日，熱毒寧注射液組、利巴韋林注射液組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均較模型組有所降低（P＜0.05）；治療第3日和第5日，熱毒寧注射液組血清和肺組織TNF-α水平較利巴韋林注射液組均降低更明顯（P＜0.05）；治療第3日，熱毒寧注射液組血清和肺組織IL-1β、IL-6水平較利巴韋林注射液組均降低更明顯（P＜0.05）。

表2 各組小鼠血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較（x±s）

3 討 論

自2016年10月至2017年2月，中國有1 258名患者感染H7N9禽流感病毒，其致死率為41%［3］。每年因季節性的流感導致300～500萬人罹患流感相關的嚴重疾病，目前疫苗只是部分有效［2］。流感病毒主要侵入機體呼吸道黏膜上皮細胞，引起內皮細胞大量釋放炎癥因子，介導過度的炎癥反應，進而細胞產生空泡、變性，并迅速產生子代病毒體擴散至鄰近細胞，重復病毒增殖周期，最終導致肺組織損傷［5］。本實驗證實流感病毒感染小鼠的肺組織中出現黏膜水腫、充血、淋巴細胞浸潤等，且流感病毒性肺炎模型小鼠的肺部炎癥病變程度與肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6的水平相一致。

研究表明，純化的流感病毒神經氨酸酶可誘導巨噬細胞釋放 IL-1、TNF-α［6］，全病毒可誘導外周血單個核細胞產生 IL-1、IL-6 和 TNF-α［7］，流感病毒誘導機體免疫反應產生的TNF-α、IL-6可直接作用于細胞、微血管等，造成組織損傷［8-9］。另有研究證實，流感病毒性肺炎模型小鼠的肺部炎癥病變程度與細胞因子TNF-α、IL-6 直接相關［10-12］，用 TNF-α 抗體治療能減輕肺部炎癥病變［13］。本研究選取流感病毒感染初期早期啟動的特異性細胞因子 TNF-α、IL-6、IL-1β為檢測指標來觀察熱毒寧注射液對流感病毒感染小鼠的炎癥反應的影響，結果發現，小鼠在感染初期血清及肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈上升趨勢，采用熱毒寧注射液和利巴韋林注射液均能降低TNF-α、IL-1β、IL-6水平，尤以熱毒寧注射液更為顯著，提示減輕由炎性因子過度釋放引起的病理損傷，改善肺指數狀。

甲型H1N1流感屬于中醫學 “瘟疫病”“疫癘病”“瘟病”的范疇，風熱犯衛證或熱毒襲肺證為初期多見證候。熱毒寧注射液具有清熱、疏風、解毒的功效，故在衛生部頒布的 《甲型H1N1流感治療方案 （2010年版）》［14］中，被推薦用于治療流感患者。前期臨床研究證實熱毒寧注射液可明顯縮短流感患者病程［4］，降低流感患者外周血炎性因子［15］。熱毒寧注射液主要成分包括環烯醚萜類、有機酸及黃酮類成分等［16］。給實驗大鼠靜脈注射熱毒寧注射液后，通過藥代動力學的方法發現其循環系統中存在熱毒寧注射液的46種化合物（19種環烯醚萜類，16種有機酸，11種黃酮類）［17］。 現代藥理學研究表明，熱毒寧注射液組方中的金銀花、梔子、青蒿具有解熱抗炎、抗氧化、抗病毒等作用。梔子苷在體外能有效抑制甲型H1N1流感病毒對MDCK細胞的CPE，在體內能有效減輕甲型H1N1流感病毒對小鼠肺部的損傷。大量體外試驗研究表明青蒿素類藥物具有抗病毒作用，對甲型流感病毒等具有較好的抑制作用?；诨钚詫虻难芯勘砻?，金銀花不同成分對H3N2和H1N1甲型流感病毒神經氨酸酶均有抑制作用［18-20］。

綜上所述，熱毒寧注射液具有抗流感病毒感染的作用，能夠減輕肺組織病變程度，正向調節炎癥因子，減緩流感感染小鼠的炎性反應，降低肺組織和血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平的表達。