苓甘五味姜辛湯對脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠免疫細胞和炎性細胞因子的影響*

王寶娟 崔利鋒 李冬霞 張云虹 楊偉鋒 馬國安

（1.河北省衡水市第二人民醫院，河北 衡水 053000；2.河北省衡水市哈勵遜國際和平醫院，河北 衡水 053000）

急性肺損傷（ALI）是由各種肺內外致病因素引起的以肺內大量炎癥細胞浸潤和滲出、肺泡上皮及毛細血管內皮屏障發生急性炎癥損傷，肺泡、肺間質水腫等為主要特征的肺部炎性綜合反映，臨床上主要表現為急性進行性血氧過低的呼吸窘迫癥、非心源性肺水腫等，最終導致呼吸衰竭，其臨床病死率高達30%～50%［1-2］，是呼吸系統的危急重癥之一，嚴重威脅到人類的生命健康。細菌內毒素是臨床上造成ALI的主要病因之一，其中又以革蘭陰性細菌內毒素為主導，而其內毒素的主要活性成分為脂多糖（LPS）。氣管內滴入LPS與呼吸道細菌感染的過程相似，LPS進入肺內后能夠引起肺內炎癥細胞增多、肺微血管通透性增高等病理改變［3］，從而造成肺部的嚴重炎性反應及炎性損傷，進而影響肺部結構功能改變，最終導致ALI的發生［4］。

苓甘五味姜辛湯源于《金匱要略》，全方由茯苓、甘草、五味子、干姜、細辛組成。方中干姜為君，既能溫肺散寒以化飲，又能溫運脾陽以化濕；細辛溫肺散寒，助干姜治其已聚之痰；茯苓健脾滲濕利水，既能杜其生痰之源，又能導水飲之邪從小便而去，二者共為臣藥，從源流配合消除痰濕，以復肺之宣降之用；五味子斂肺氣以平咳喘，與細辛配伍，一收一散，共奏斂不留邪、散不傷正之功，且能調節肺司開合之職；甘草調和諸藥。全方共奏具有溫肺化飲之功效，常用于寒飲內停之咳喘。目前臨床多用于治療咳嗽、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘等肺系疾病［5-8］。本研究擬觀察苓甘五味姜辛湯對LPS致ALI大鼠動脈血T淋巴細胞亞群和支氣管肺泡灌洗液 （BALF）中白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響，并探討其對ALI的可能作用及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康清潔級的2月齡SD大鼠90 只，雌雄各半，體質量（200±20） g，由中國食品藥品檢定研究院提供，合格證號：SCXK（京）2012-0068。飼養條件：無特殊病原菌（SPF）級環境，恒溫22～25℃，恒濕50%～65%。

1.2 試藥與儀器 苓甘五味姜辛湯方藥組成：茯苓12 g，甘草 9 g，五味子 5 g，干姜 9 g，細辛 5 g，桂枝 9 g。將藥材加4倍量水煎煮60 min，紗布過濾后將濾液另器置放，濾渣再加入3倍量水煎煮30 min后過濾，2次煎煮液混合后水浴濃縮至原藥材含量為0.8 g/mL，4℃放置備用，臨用時用蒸餾水稀釋。地塞米松注射液（批號130257，天津天藥藥業股份有限公司）；LPS（批號20161019，Sigma公司，德國）；FITC標記的抗大鼠CD3單克隆抗體、PE標記的抗大鼠CD4和CD8單克隆抗體（美國 Caltag公司）；IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 酶聯免疫吸附測定試劑盒（法國Diaclone公司）。主要儀器設備：大鼠固定操作臺 （PENN-CENTURY公司，美國）；3K15 型低溫高速離心機（Sigma公司，德國）；CO2培養箱（Yamato公司，日本）；光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；DYZ-22A型雙恒定時電泳儀（北京市六一儀器廠）；DYY-Ⅲ橋式電泳槽 （北京市六一儀器廠）；BD-LSR型流式細胞儀 （Becton Dichinson公司，美國）；2016型切片機（上海萊卡儀器有限公司）。

1.3 動物分組 90只大鼠實驗前適應性喂養1周后，按隨機數字表法分成6組，每組15只，分別為空白對照組、ALI模型組、地塞米松組和苓甘五味姜辛湯高、中、低劑量組（以下簡稱中藥高、中、低劑量組）。

1.4 造模與給藥 1）動物造模。采用LPS暴露式氣管滴注方法制備大鼠ALI模型［10］：末次給藥24 h后，除空白對照組外的5組大鼠用10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術板上，頸部消毒，縱向切開頸部皮膚，剝離皮下組織，暴露氣管，用2 mL注射器從氣管兩氣管環間快速刺入，在大鼠直立位下滴入脂多糖溶液10 mg/kg，輕度晃動數次以使液體能夠均勻分布于肺內后縫合切口以制作ALI模型。大鼠自然清醒后自由活動，禁食，未禁水。2）干預方法。大鼠給藥劑量按人與大鼠之間體表面積折算［9］等效劑量為4 g/kg，高劑量為2倍等效劑量，低劑量為1/2倍等效劑量，按上述給藥量，用蒸餾水將苓甘五味姜辛湯煎煮液配置成中藥高、中、低劑量濃度分別為0.8、0.4、0.2 g/mL。空白對照組和模型組給予等劑量的0.9%氯化鈉注射液灌胃，地塞米松組取地塞米松注射液1.0 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續用藥27 d。

1.5 標本采集與檢測 1）實驗取材：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經舌靜脈注入肝素抗凝，收集大鼠腹主動脈血保存待用；處死大鼠后將其仰臥位固定，使用無菌剪刀剪開大鼠頸部和胸部的皮膚組織，暴露胸腔，將大鼠右主支氣管結扎后，用注射器在主氣管上向肺部注入磷酸鹽緩沖液2 mL進行左肺灌洗，重復3次后留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）備用。2）肺組織病理學檢測及病理學評分：取大鼠右肺中葉組織，用10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋后切片（片厚5 μm），取切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色；光鏡下觀察肺組織病理形態學改變，并進行病理學評分［11］。 3）肺濕/干質量比測定：取大鼠右肺下葉組織，先除去表面脂肪組織，再用濾紙吸干組織表面的液體后稱量肺組織的濕質量；將肺組織置于70℃烘箱48 h至恒重后再次稱量其干質量，并計算肺組織濕/干質量比（W/D）值，用來評估肺組織水腫程度。4）大鼠動脈血中CD3+、CD4+和CD8+的測定［12］：按照試劑盒說明書的步驟，采用流式細胞技術對大鼠腹主動脈血中T淋巴細胞亞群進行測定［1］。5）大鼠 BALF 中 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α水平的測定［13］：按試劑盒說明書方法，采用ELISA法測定 IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α 因子的濃度。

1.6 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態改變及病理學評分見圖1，表1。顯微鏡下觀察見空白對照組大鼠肺組織形態、肺泡結構正常，肺泡壁薄，間隔無水腫，無明顯炎癥改變。ALI模型組大鼠肺組織結構出現破壞，部分肺泡塌陷，肺泡水腫明顯，肺泡間隔明顯增厚，肺泡壁有大量中性粒細胞浸潤及滲出物，肺泡腔內炎癥細胞浸潤，肺間質彌漫性充血水腫。地塞米松組及中藥高劑量、中劑量組的肺組織上述變化較模型組明顯減輕，炎癥細胞浸潤數量減少，充血、水腫程度減輕，且肺組織結構明顯改善。中藥低劑量組肺組織結構改善不明顯，肺泡腔內仍有大量炎癥細胞浸潤，肺間質部分充血水腫。病理學評分方面，ALI模型組評分明顯高于空白對照組（P＜0.05），經不同藥物干預后，地塞米松組和中藥高、中劑量組評分均明顯降低（P＜0.05），中藥低劑量組評分降低不明顯（P＞0.05），中藥各組與地塞米松組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態改變（HE染色，200倍）

表1 各組大鼠病理學評分及W/D比值比較（x±s）

2.2 各組大鼠肺組織W/D比值情況比較 見表1。與空白對照組相比，ALI模型組肺組織水腫明顯，W/D比值明顯增加，差異存在統計學意義（P＜0.05）。地塞米松組與中藥高劑量組、中劑量組肺組織水腫現象較ALI模型組明顯減輕，W/D比值降低，有顯著差異（P＜0.05）。中藥低劑量組肺組織W/D比值較ALI模型組降低不明顯（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠動脈血 CD3+、CD4+、CD8+和 CD4+/CD8+水平比較 見表2。ALI模型組動脈血中CD3+、CD4+、和CD4+/CD8+水平較空白對照組明顯降低（P＜0.05），CD8+水平明顯升高（P＜0.05）。 與 ALI模型組比較，中藥高劑量組、中劑量組動脈血中CD3+、CD4+和CD4+/CD8+水平明顯升高（P＜0.05），CD8+水平明顯降低（P＜0.05）；地塞米松組和中藥低劑量組與ALI模型組相比各項指標變化不明顯（P＞0.05）。

表2 各組大鼠CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平比較（%，x±s）

2.4 各組大鼠 BALF中 IL-1β、IL-6、IL-8和 TNF-α水平比較 見表3。LPS造模后大鼠BALF中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平均升高，與空白對照組比較差異顯著（P＜0.05）；經高、中劑量的中藥處理可顯著降低各項指標的水平，與地塞米松組效果相當，與ALI模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠 IL-1β、IL-6、IL-8 和 TNF-α 水平比較（x±s）

3 討 論

近年來，采用氣管內滴入LPS的方式制作ALI動物模型的方法已經廣泛運用于ALI發病機理和藥物防治的研究［14］。因為LPS不僅能損傷肺臟，還能激活多種炎癥細胞，使其釋放大量炎癥介質或細胞因子，進而導致肺組織損傷［15］。本研究中大鼠氣管內滴注LPS后，出現大鼠肺組織結構破壞、肺泡炎癥細胞浸潤等典型的ALI病理改變，提示本研究成功建立了ALI的動物模型。同時ALI模型大鼠肺組織病理學評分以及W/D比值升高，表明LPS氣管內滴藥能引起明顯的大鼠肺組織損傷。而苓甘五味姜辛湯干預后能明顯減輕損傷，降低肺組織病理學評分和W/D比值，提示苓甘五味姜辛湯對ALI大鼠的肺臟有明顯的保護作用。

T淋巴細胞亞群是細胞免疫的主要組成部分，其中，CD3+是鑒定 T 細胞的重要標記［16］；CD4+能誘導和輔助細胞毒T細胞前身成為細胞毒T細胞，輔助其他免疫細胞功能的發揮，其數量的減少代表機體免疫功能的降低［17］；CD8+主要分布在抑制性和殺傷性T淋巴細胞表面，通過自身和抑制因子在免疫反應中起負向調節作用，若其細胞數量過多反而會對機體造成損傷；CD4+/CD8+則能反映機體免疫功能是否紊亂，并且其下降程度與疾病的嚴重程度、預后均密切相關［18］。本研究結果顯示，ALI大鼠動脈血中CD3+、CD4+和CD4+/CD8+值降低，CD8+升高，提示LPS造模后能引起T淋巴細胞亞群的表達異常，從而導致ALI和免疫抑制。而經高、中劑量苓甘五味姜辛湯干預后，以上指標均有所恢復，表明苓甘五味姜辛湯能提高機體免疫力，糾正機體細胞免疫抑制狀態。

ALI的主要特點是炎癥介質大量合成和釋放，IL-1β，IL-6、IL-8以及TNF-α等促炎介質的水平，可反映肺組織炎癥反應的強度［19］。IL-1β是急性炎癥反應的主要調節物質，并且能夠誘導產生IL-6和IL-8等［20］。IL-6是強有力的促炎因子，主要參與肺損傷時肺內炎癥的過度反應，其不僅能對組織直接造成傷害，還能增強組織細胞對TNF-α的敏感性［21］。IL-8是中性粒細胞最有效和最主要的趨化因子，能促使中性粒細胞活化和遷移，釋放出大量的損傷介質引起肺損傷［22］。TNF-α是ALI最重要的啟動因子，能趨化炎癥細胞在肺內聚集、黏附，從而損傷肺血管內皮細胞［23］。TNF-α還能使炎癥細胞釋放IL-1β、IL-6和IL-8等二級炎癥因子，加重肺組織炎癥損傷［24］。本實驗結果表明，LPS造模后大鼠 BALF 中 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 水平顯著升高，其原因可能是因為ALI后導致肺泡毛細血管屏障下降，白細胞向肺泡內遷移，被激活的細胞進而產生 IL-1β、IL-6、IL-8等多種炎性遞質以及 TNF-α等前炎性遞質；而經苓甘五味姜辛湯干預后可顯著降低其水平，表明苓甘五味姜辛湯可以抑制IL-1β、IL-6、IL-8以及TNF-α等炎性因子的合成和釋放，從而減輕肺組織的炎性損傷程度。

綜上所述，苓甘五味姜辛湯能減輕肺損傷，改善肺水腫，提高機體免疫力，糾正機體細胞免疫抑制狀態，抑制 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的合成和釋放，為臨床救治ALI提供了新思路。