腦缺血后處理調節自噬保護缺血性腦卒中研究進展

郭艷俠,王 玨,馮 娟

(中國醫科大學附屬盛京醫院神經內科，沈陽 110004)

腦卒中是一種突然起病的腦血液循環障礙性疾病，目前已成為全球第二大死亡原因，也是導致腦血管病患者殘疾的主要原因[1]。缺血性腦卒中的發病率高，已成為研究熱點。缺血性腦卒中治療主要包括血管再通及藥物治療等。由于血管再通后的快速再灌注會加重組織細胞功能代謝障礙及細胞結構破壞，在缺血損傷的基礎上進一步導致再灌注損傷，而藥物治療只能針對單一損傷機制，治療效果欠佳。因而，近年來對于缺血性腦卒中治療的研究主要聚焦于通過外源性干預措施激活內源性腦保護機制。由此產生了外源性機械干預治療。腦缺血后處理是指在缺血再灌注后一定時間內，給予1次或多次短暫性缺血再灌注，使腦組織對前面較長時間的缺血產生耐受性[2-3]。腦缺血后處理發揮保護作用的分子機制尚不明確。隨著人們對缺血再灌注過程中自噬機制認識的加深，對腦缺血治療的保護機制研究也逐漸轉向其對于自噬過程的調節，有研究認為，自噬可作為缺血以及藥物預處理的最終效應器[4-5]。由此，缺血后處理可能通過調節自噬對缺血性腦卒中發揮保護作用?，F對缺血后處理調節自噬在缺血性腦卒中過程中發揮的保護作用的研究進展予以綜述。

1 腦缺血再灌注損傷對自噬過程的調節

一些應激狀態如缺氧、能量缺乏、氧化應激、內質網應激及蛋白質的大量聚集可激活自噬，自噬可介導細胞質內的長壽蛋白被溶酶體降解清除[6]。目前已發現有三十多種自噬相關基因參與調節自噬過程，當缺血及再灌注時間較短時，自噬過程被激活[7-9]，而長時間的缺血或再灌注可抑制自噬[9]，即自噬的激活或者抑制受缺血及再灌注的強度及時間的影響。

盡管腦缺血再灌注損傷導致神經元內自噬的激活已被廣泛證實，但自噬激活的作用尚不明確。自噬激活可以大量清除細胞內的蛋白質及細胞器[10]。在自噬性降解過程中，膜性結構形成的囊泡包裹蛋白質，囊泡與溶酶體融合，通過溶酶體酶使囊泡內容物被降解，并被重新利用[11-12]。除了蛋白質，線粒體、過氧化物酶體、高爾基體及內質網等細胞器也被自噬過程清除，對酵母的研究還發現，部分細胞核區域也可被自噬選擇性清除[13]。因而，自噬可以通過清除細胞內損傷的細胞器、毒性代謝產物及細胞內的病原體，促進細胞內物質及能量的重新利用發揮保護作用。神經元自噬水平降低可以導致大量的神經元丟失，以及神經功能缺失，最終引起或者加重神經退行性疾病[14]，在新生鼠腦缺血缺氧性損傷中，激活自噬可減少神經元死亡，減輕腦損傷[15]，說明自噬的激活可對腦缺血再灌注損傷發揮保護作用。然而，自噬也可以通過過量的自我吞噬以及對于細胞內必需組分的降解或者與凋亡過程相互作用促進細胞死亡。在胚胎發育及激素依賴性腫瘤的治療過程中，自噬呈現為一種細胞死亡形式[16]。在程序性細胞死亡過程中，凋亡作為Ⅰ型細胞死亡形式，而自噬則為與凋亡不同的Ⅱ型細胞死亡形式[17]，抑制自噬可減輕腦缺血再灌注損傷，對新生鼠進行選擇性中樞神經系統自噬相關基因7敲除可阻礙缺血缺氧性腦損傷后胱天蛋白酶(caspase)依賴和非依賴性神經元死亡[18]。綜上，腦缺血再灌注損傷可激活自噬，而自噬激活發揮促進細胞存活作用還是導致細胞死亡作用尚不明確，自噬的作用可能由缺血的時程、缺血強度以及再灌注的時間及強度決定。有研究認為，自噬在缺血與再灌注過程發揮不同作用。小鼠永久性腦缺血激活自噬發揮破壞性作用，而短暫腦缺血60 min再灌注后立即應用3-甲基腺嘌(3-methyladenine,3-MA)抑制自噬可在再灌注24 h增加梗死體積，即再灌注過程中自噬的激活發揮保護作用[19]，而在心肌缺血再灌注損傷過程中，缺血過程中自噬的激活具有保護作用，再灌注過程中自噬發揮破壞作用[20]。在輕度刺激，如短暫缺血或者低度氧化應激情況下，自噬可以清除破壞的細胞器，促進大分子物質及能量的重新利用，維持細胞穩態促進存活，反之，長時間缺血及再灌注可導致過量的長時程的自噬激活，通過過量吞噬必需的細胞器和蛋白質導致細胞死亡[21]。

2 缺血后處理通過調節自噬過程發揮保護作用

研究證實缺血及藥物后處理可通過抑制自噬發揮保護作用。永久性大腦中動脈閉塞時，后處理可通過抑制自噬發揮保護作用，大鼠永久性大腦中動脈閉塞后，立即應用3-MA，可在3 h后減低自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ(light chain 3-Ⅱ，LC3Ⅱ)和組織蛋白酶B水平，24 h后增加Bcl-2水平，并在1、3、7 d減小梗死體積，改善神經功能[22]；新生鼠永久性大腦中動脈閉塞加頸總動脈夾閉90 min模型證實，在缺血后應用3-MA，可以減小46%的梗死體積，且可以抑制caspase依賴性與非依賴性凋亡[10]；大鼠永久性大腦中動脈閉塞加雙側頸總動脈夾閉30 min，可以激活自噬，缺血后立即應用3-MA，可抑制自噬，并減小缺血后24 h腦梗死體積及腦水腫[23]，在此模型中進行3個循環30 s再灌注，10 s頸總動脈夾閉作為缺血后處理，可在缺血再灌注后24 h減低LC3Ⅱ及Belin1蛋白水平，增加p62水平，減小梗死體積及腦水腫，后處理同時應用雷帕霉素，可激活自噬，減弱后處理的保護作用，而在缺血后應用3-MA可以增加Bcl-2水平，發揮與缺血后處理類似的腦保護作用[23]；全腦缺血后，藥物后處理也可抑制自噬，大鼠10 min雙側頸總動脈夾閉模型模擬短暫全腦缺血，此后使用丙泊酚(50 mg/kg或100 mg/kg)進行后處理，可在缺血再灌注后12 h，減低LC3Ⅱ蛋白水平，減少自噬體及溶酶體，且增加存活神經元數量，缺血后10 min應用3-MA可發揮與丙泊酚類似的作用[24]，由于丙泊酚可與p53抑制劑，以及核因子κB抑制劑(SN50)發揮類似的抑制自噬和凋亡的作用，推測丙泊酚通過抑制核因子κB/p53通路，抑制自噬，保護短暫全腦缺血再灌注損傷[25]。體外實驗也證實了后處理抑制自噬保護腦損傷的作用，使用PC12細胞氧糖剝奪模擬缺血再灌注，證實丙泊酚后處理可抑制自噬，增加存活神經元數量[24]。

然而，也有研究認為后處理通過激活自噬發揮保護作用。大鼠短暫局灶性腦缺血,大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)2 h，MCAO后立即或者再灌注10 min后，雙側股動脈夾閉10 min后再灌注10 min重復3次作為遠端后處理，可在再灌注22 h減小梗死體積，改善神經功能，MCAO后立即進行遠端后處理可增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，且LC3Ⅱ陽性的細胞多為神經元，遠端后處理通過蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)/糖原合成酶激酶3B通路激活自噬[26]。心肌缺血30 min再灌注120 min后缺血后處理，可以激活自噬，應用3-MA可抑制自噬并廢除后處理的保護作用。

3 后處理調節自噬過程機制

缺血后處理與自噬之間的關系尚不明確，但缺血后處理發揮保護作用的機制與自噬機制之間具有緊密的聯系。

3.1哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR) mTOR是兩種不同復合物mTOR復合物(mammalian target of rapamycin complex，mTORC)1和mTORC2的催化核心，兩者都包含G蛋白β亞單位樣蛋白和含有DEP序列區的雷帕霉素靶蛋白，此外各自由不同的功能蛋白組成。mTORC2的作用尚不明確，其可激活Akt及蛋白激酶C，參與細胞存活和細胞骨架的調節[27]。mTORC1可整合生長因子及營養信號激活其下游的S6K1和S6，抑制真核翻譯起始因子4E結合蛋白1，影響蛋白質合成、細胞生長，以及核糖體的生物合成[28]，mTORC1還參與調節自噬過程，營養充足條件下，mTORC1可被激活，導致mTOR結合蛋白raptor與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1結合，使絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1及自噬相關基因13發生磷酸化進而抑制自噬。在應用雷帕霉素或者能量不足情況下，mTORC1的抑制會抑制自噬相關蛋白1以及自噬相關基因13的磷酸化，激活自噬[29]。心臟缺血損傷過程中，能量缺乏會導致ATP減少，增加腺苷一磷酸含量，由此激活腺苷一磷酸激酶,腺苷一磷酸激酶的激活會抑制mTOR活性，上調自噬[30]。此外，mTOR活性還受到Akt的調節，Akt磷酸化后可使結節性硬化癥1/結節性硬化癥2復合物發生磷酸化，并抑制其活性，結節性硬化癥1/結節性硬化癥2復合物活性的抑制可以激活Rheb，由此激活mTOR[31]，Akt還可通過抑制mTORC1的抑制物蛋白酶激活受體40，激活mTORC1[32]。Akt/mTOR通路可參與調節自噬過程，研究發現，心肌缺血再灌注損傷，乙醛脫氫酶的線粒體異構體的過表達可在缺血過程中誘導腺苷一磷酸激酶的激活，抑制mTOR,激活自噬，而在再灌注過程中，可通過激活Akt激活mTORC,抑制自噬[29]。將荷花堿應用于人肺癌細胞系A549，可以通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/Akt/mTOR通路，激活自噬，誘導自噬性細胞死亡，發揮抗癌作用[30]。

3.2自噬效應蛋白(Beclin1) Beclin1是一種與Bcl-2相互作用的蛋白，在哺乳動物細胞中可作為自噬的上游調節子。有研究認為Beclin1依賴性自噬的下調或者抑制可以在缺血再灌注損傷中發揮保護作用[33]。在大鼠MCAO模型中，在制備腦缺血模型前7 d側腦室內注射Beclin1小干擾RNA減低Beclin1表達，抑制自噬，可在再灌注后14 d減小梗死體積，改善神經功能[33]；在心肌缺血再灌注損傷過程中Beclin1依賴性自噬的激活發揮破壞性作用[20]。然而，也有研究認為Beclin1依賴性自噬的上調具有保護作用，在大鼠腦中Beclin1的上調可以抑制辛德畢斯病毒的復制，并通過抑制凋亡，發揮對于神經元的保護作用[34]；在心肌細胞缺血損傷中，Beclin1的下調或者其與Bcl-2相互作用的增加會增加心肌細胞自噬[35]。因而Beclin1依賴性自噬在缺血再灌注損傷中的作用存在爭議。

3.3PI3K PI3KⅠ和PI3KⅢ在自噬的調節過程中發揮不同的作用，PI3KⅠ可通過激活Akt/mTOR信號通路抑制自噬[36]，而PI3KⅢ與Beclin1以及其他的蛋白質形成復合物，聚集自噬體膜形成必需的蛋白誘導自噬[37]。大鼠永久性腦缺血，電鏡發現自噬體和自噬溶酶體增加的神經元，同時顯示細胞早期凋亡和壞死的形態學改變，使用PI3KⅢ抑制劑3-MA，可以減小梗死體積，腦水腫及神經功能損傷；大鼠全腦缺血后應用3-MA可抑制凋亡，抑制組織蛋白酶B的釋放，發揮保護作用，提示PI3KⅢ介導的自噬在腦缺血損傷中發揮破壞性作用。然而也有研究認為PI3KⅢ介導自噬在缺血再灌注損傷中發揮保護作用，在腦缺血再灌注損傷前應用3-MA，可加劇腦損傷[38]。在缺血預處理前應用3-MA抑制PI3KⅢ，可抑制缺血預處理的神經保護作用。腦缺血后處理可以減小梗死體積，具有腦保護作用，mTOR抑制劑雷帕霉素會阻斷缺血后處理的保護作用，而3-MA可模擬后處理的保護作用[15]；應用丙泊酚作缺血后處理可抑制自噬，減低PI3KⅢ的水平，增加存活神經元數量，發揮保護作用[25]。

3.4高遷移率組蛋白1(high mobility group protein B1,HMGB1) HMGB1為一種高度保守的非組蛋白核DNA結合蛋白，在大多數的真核細胞中表達，也可以表達于神經元[39]。細胞核內的HMGB1可與DNA結合促使核小體的穩定形成，并維持細胞核穩態。應激情況下，HMGB1可由損傷細胞(如激活的巨噬細胞，自然殺傷細胞，樹突狀細胞)主動分泌[40]，也可由損傷或壞死的細胞被動釋放到細胞外[41]。創傷性腦損傷與缺血性腦卒中都可導致HMGB1的釋放，在大鼠MCAO模型及缺血性腦卒中患者中都可以觀察到血清中HMGB1水平的升高[42-43]。細胞外的HMGB1可通過與其受體的結合激活下游通路導致細胞因子及其他促炎因子的上調。近年來，多種藥物可通過減低血清中的HMGB1水平對腦缺血再灌注損傷發揮保護作用[44-46]。在不同部位表達的HMGB1都可以對自噬過程發揮調節作用，細胞核中的HMGB1通過上調熱激蛋白β-1調節自噬及線粒體自噬過程中的膜平衡[47]，細胞質中的HMGB1通過與Beclin1結合誘導自噬[48]，細胞外的HMGB1可通過與其受體RAGE結合誘導自噬[49]。由此推測，腦缺血再灌注及缺血后處理可能通過HMGB1依賴性途徑調節自噬過程。

3.5活性氧類 腦缺血再灌注損傷可以產生大量的活性氧類，活性氧類主要包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基。中樞神經系統中，超氧負離子最為重要，其由呼吸鏈產生，是黃嘌呤氧化酶和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的產物。超氧陰離子被超氧化物歧化酶催化轉化為過氧化氫，過氧化氫在催化酶作用下轉變為水和氧氣。缺血再灌注過程中活性氧類的產生主要分為三個時相：①氧糖剝奪過程中，與線粒體去極化過程一致，當線粒體電位丟失時停止。氧糖剝奪可抑制線粒體呼吸復合物Ⅳ，導致呼吸鏈中間產物的積累以產生活性氧類。②氧糖剝奪后25～35 min，細胞內ATP消耗，導致腺苷酸核苷酸聚集形成次黃嘌呤和黃嘌呤，作為黃嘌呤氧化酶的底物，使黃嘌呤氧化酶激活導致大量活性氧類產生。③快速恢復血供時，組織氧合水平快速提高，導致活性氧類大量產生，此期的活性氧類產生主要由于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活[50]?；钚匝躅愔饕谠俟嘧⒑? min內產生，而且是導致再灌注損傷的主要原因?；钚匝躅惖漠a生可以激活自噬，使用脂多糖處理新生鼠心肌細胞可以增加活性氧類的產生并激活自噬[51]。在U87和HeLa細胞中，線粒體電子轉移鏈復合物Ⅰ和Ⅱ的抑制可以增加活性氧類產生并上調自噬，活性氧類清除劑可抑制自噬[52]。后處理可減低缺血再灌注損傷過程中產生的過量的活性氧類，缺血后處理(2 h缺血后3個循環,每個循環30 s缺血加30 s再灌注)可以減小梗死體積、過氧化氫水平，增加超氧化物歧化酶、催化酶以及蛋白酶體活性，減少蛋白羧基衍生物，發揮保護作用[53]，與此同時，后處理的保護作用還依賴于氧化還原信號，腦缺血再灌注損傷后，肢體遠端后處理可抑制蛋白激酶C，減小梗死體積，抑制凋亡，使用氧自由基清除劑會抑制后處理的保護作用[54]。則后處理可通過調控活性氧類，使缺血再灌注損傷后自噬維持在合適的水平，發揮保護作用。

3.6內質網應激 內質網在保證蛋白質的正確合成和折疊以及維持細胞內鈣穩態中發揮重要作用，內質網所處環境或者其功能的破壞可誘導內質網應激，導致非折疊或者錯誤折疊的蛋白累積。內質網應激可以激活未折疊蛋白反應，通過內質網分子伴侶蛋白降解錯誤折疊的蛋白。研究證實，大鼠心臟缺血再灌注損傷會激活未折疊蛋白反應[55]，內質網應激累積的錯誤折疊蛋白通過蛋白酶體降解，過量的非折疊蛋白通過自噬降解，維持細胞穩態[56]。反之，細胞經歷內質網應激時抑制自噬會導致細胞死亡[57]。嚴重缺血再灌注損傷會導致持續嚴重的內質網應激，此時，未折疊蛋白反應和自噬的作用由保護轉為導致細胞死亡[58]。預處理可以通過激活自噬，抑制缺血再灌注過程中過度的內質網應激[59]，發揮保護作用。心肌缺血再灌注損傷，缺血后處理可抑制內質網應激，其機制可能是通過蛋白激酶C與鈣感應受體相互作用[60]，抑制鈣感應受體[61]，抑制p53上調凋亡調節因子[62]，并有絲裂原激活蛋白激酶、Jun激酶通路[63]的參與。也有研究表明心肌缺血后處理可激活內質網應激，心肌缺血后3個循環，每個循環10 s缺血加10 s再灌注后處理，減小梗死體積，應用免疫印跡實驗檢測蛋白含量發現葡萄糖調節蛋白78和激活的轉錄因子6增加，提示內質網應激增加，心肌缺血前1 h應用內質網應激抑制劑4-苯基丁酸，消除了后處理的保護作用，減低后處理導致的葡萄糖調節蛋白78和激活的轉錄因子6增加[64],腦缺血再灌注損傷，后處理可以抑制內質網應激，大鼠大腦中動脈永久性閉塞及雙側頸總動脈閉塞30 min后處理，24 h后內質網應激蛋白及caspase-12明顯減少，葡萄糖調節蛋白78增加[65]。推測后處理可通過抑制內質網應激，減少缺血再灌注損傷中過度的自噬，發揮保護作用。

3.7線粒體 損傷的線粒體表現膜電位降低，產生過量的活性氧類，激活自噬以清除活性氧類，即線粒體自噬，缺血再灌注過程中，線粒體可以釋放促凋亡因子和細胞色素C，產生大量的活性氧類，導致凋亡和壞死，因而通過線粒體自噬清除損傷的線粒體可發揮保護作用。線粒體片段化和線粒體裂隙可以誘導線粒體自噬[66]，在缺血損傷時，線粒體裂隙產生于自噬上調之前，抑制缺血導致的線粒體裂隙可減少自噬[67]，此外，研究發現，心肌缺血再灌注損傷后，線粒體膜通透性轉移孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放可誘導線粒體自噬，抑制MPTP會減弱自噬的激活[68]。嚴重的缺血再灌注損傷導致自噬大量激活，而過度的自噬會造成線粒體功能受損導致壞死或者凋亡[69]。缺血預處理可以通過使線粒體內膜輕度去極化，開放線粒體KATP通道或者短暫開放MPTP激活自噬發揮保護作用[70]。與預處理不同，缺血后處理可抑制MPTP的開放，阻止線粒體內膜膜電位的去極化，缺血后處理與MPTP抑制劑環孢菌素A都可減小梗死體積，改善神經功能缺失，MPTP的激活劑蒼術苷會逆轉缺血后處理的保護作用[71]。推測缺血后處理可能通過抑制MPTP的開放，增加缺血再灌注導致的線粒體膜電位的降低，抑制缺血再灌注過程中的過度自噬發揮保護作用。

4 小 結

由于自噬過程在腦缺血再灌注損傷中具有重要意義，缺血后處理作為發揮腦保護作用的重要措施，可通過多種途徑及機制(其中包括mTOR，Beclin1，PI3K，HMGB1，活性氧類，內質網應激及線粒體等)調節自噬過程。然而，缺血后處理如何調節自噬過程，以及其通過自噬過程發揮對于缺血性腦卒中的保護作用的具體分子機制尚不明確，因而，研究缺血后處理對于腦缺血再灌注損傷中自噬過程的調節作用，及其發揮保護作用的具體機制至關重要。