血漿內毒素檢測在革蘭陰性菌引起肺部感染診斷中的應用

楊 辛，吳穎稚，范 君，錢重玲，林 潔，李 菁，張慶五，曹啟迪

(1.上海市楊浦區控江醫院檢驗科，上海 200093； 2.上海市楊浦區滬東老年護理醫院檢驗科，上海 200082)

肺部感染是呼吸系統最常見多發的疾病之一，其病因是由于肺部感染病原微生物(以細菌感染為主)而引起的炎癥。免疫功能低下，臨床表現不典型，早期診斷困難。致使患者出現咳嗽、咳痰，伴或不伴胸痛，發熱。由于肺部感染病原體種類不同，感染何種病原體不明，無法針對敏感菌準確用藥，致使大量使用廣譜抗生素，造成致病微生物的基因發生改變而產生耐藥，其中以革蘭陰性菌最為突出[1-2]。所以臨床往往急需病原體檢測，而常規細菌培養所需時間較長，為4～6 d，而且采集標本易污染，真陽性率不高，不利于疾病治療[3]。近年來對細菌感染快速檢測診斷的新試驗項目不斷增加，血漿內毒素對革蘭陰性菌感染早期鑒別具有一定的診斷價值，革蘭陰性菌的細胞壁上含有脂多糖，而其他革蘭陽性菌、真菌、動物及人的細胞成分和血漿中均不含脂多糖成分，如果在感染患者血漿中檢測到脂多糖，是診斷革蘭陰性菌感染的有效依據[4]。本研究采用血漿內毒素動態光度比濁法對肺部感染患者脂多糖水平進行檢測，旨在探討其在革蘭陰性菌診斷中的應用價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年5月上海市楊浦區控江醫院確診為肺部感染患者277例，其中男235例、女42例,年齡62～82歲，平均(73.3±1.2)歲；病程11～15 d,平均(13±2.0) d。納入標準；符合2009年《臨床診療指南；呼吸病學分冊》肺部感染的診斷標準[5]；排除標準：排除肺部腫瘤、肺水腫、肺不張、肺栓塞等疾病，病毒性感染，自身免疫性疾病及過敏性疾病所致免疫功能紊亂的患者。

1.2儀器和試劑 采用法國(梅里埃)VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀及相應革蘭陽性菌，革蘭陰性菌藥敏卡均由法國梅里埃生物有限公司提供，上海市臨床檢驗中心提供細菌質控標準菌株大腸埃希菌(ATCC25922),金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，銅綠假單胞菌(ATCC27853)由細菌室保存。血平板，麥康凱及巧克力平板均由上海市康勤科技有限公司提供，采用英國(萊伯金耐特)LKMO2-32型動態試管檢測儀(英國萊伯金耐特生物有限公司)檢測內毒素水平，TAL-80試管恒溫儀、革蘭陰性菌脂多糖檢測試劑盒(批號：1703240)及質控品均由廣東湛江安度斯生物有限公司提供。

1.3方法

1.3.1血漿內毒素檢測 采用革蘭陰性菌脂多糖動態光度濁法檢測血漿內毒素水平:①采用無菌，無熱源真空采血管采集靜脈血3 mL，離心半徑為10 cm,3 000 r/m離心10 min后，吸取上層富有血小板的血漿0.1 mL加入0.9 mL樣品稀釋液中后，放入TAL-80試管恒溫儀中進行75 ℃保溫10 min和冷卻5 min后，配制成檢測血漿。②取0.25 mL試劑復溶液加入反應試劑中，搖勻靜置2 min配制成反應液。③加入0.1 mL檢測血漿和50 μL反應液于反應管中，混勻后插入LKM-02-32型動態試管測試儀中檢測75 min反應結束后，自動計算血漿中內毒素的含量[6-7]。血漿內毒素定量檢測結果分析：<0.053 EU/mL為正常值；0.053～0.109 EU/mL為臨床觀察期；>0.109 EU/mL為革蘭陰性菌感染[8-9]。

1.3.2痰液細菌培養檢測 受試者晨起洗漱后，深咳留取痰液于無菌試管內30 min送檢，收到標本后初步鏡檢和革蘭染色。合格標本判斷標準為鱗狀上皮細胞<10個/低倍視野，白細胞>25個/低倍視野為合格標本進行痰液培養[10]。先將痰液標本及時接種血平板，麥康凱和巧克力平板，放入35 ℃孵箱孵育24～48 h后取出。如懷疑有致病菌進行革蘭染色，鏡檢區分陽性和陰性，確定后挑取單個菌落于2.0 mL無菌0.9% NaCl溶液中，調整菌落濁度為0.5麥氏比濁度后，分別接種于鑒定藥敏板，放入VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀中，24 h后自動出結果[11]。痰液細菌培養鑒定結果判定；根據文獻[12-13]，按法國梅里埃生物有限公司提供的VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀細菌鑒定評估標準說明書進行評定。

2 結 果

2.1痰細菌培養陽性率分布情況 277例肺部感染患者中，革蘭陰性菌感染196例，陽性率為79.76%，分別為大腸埃希菌30例，銅綠假單胞菌52例，肺炎克雷伯菌94例，奇異性變形桿菌12例，鮑曼不動桿菌8例。革蘭陽性菌感染81例，陽性率為29.24%，分別為金黃色葡萄球菌72例，肺炎雙球菌9例。

2.2內毒素含量水平檢測結果比較 196例革蘭陰性菌感染患者血漿內毒素水平為(0.283±0.108) EU/mL，81例革蘭陽性菌感染患者血漿內毒素水平為(0.034±0.010) EU/mL。革蘭陰性菌感染組與革蘭陽性菌感染組內毒素水平比較差異有統計學意義(t=29.773,P=0.001)。

2.3血漿內毒素與痰液細菌培養檢測結果比較 以細菌培養結果作為金標準，血漿內毒素檢測的靈敏度為97.44%，特異度為83.95%，陽性預測值為94.08%，陰性預測值為93.24%,準確度為93.86%。見表1。

表1 血漿內毒素與痰細菌培養檢測陽性結果比較 (例)

3 討 論

內毒素是革蘭陰性菌細胞壁中的一種成分，稱之為脂多糖。脂多糖對宿主具有毒性作用。內毒素只有當細菌死亡或裂解破壞菌細胞后才釋放出來。革蘭陰性菌是肺部感染的主要致病菌，臨床上最常用痰培養來鑒定感染細菌的種類，并同時提供藥物敏感試驗結果。但培養時間較長，需4～6 d，無法提供及時的檢驗結果[14]。近年來，實驗室運用血漿內毒素檢測，不但可以快速鑒別致病菌種類，而且具有高度敏感性，尤其是革蘭陰性菌感染，檢測時間短，操作簡單僅需2 h便可出結果，能及時為臨床醫師提供早期診斷和針對敏感菌如何應用抗感染藥物治療進行有效指導[15-16]。

本研究結果顯示，277例肺部感染患者中，痰細菌培養陽性率分別為革蘭陰性菌感染196例，陽性率為79.76%，革蘭陽性感染81例，陽性率為29.24%，革蘭陰性菌感染組血漿內毒素水平明顯高于革蘭陽性感染組(P<0.01)，因為革蘭陰性菌裂解后釋放出來內毒素是其細胞壁中的脂多糖組分，因此對于革蘭陰性菌致病的肺部感染的患者，檢測血漿內毒素可以確定革蘭陰性菌感染，并且進行針對革蘭陰性菌的抗生素治療。如果肺部感染患者依賴血常規檢查結果，發現白細胞計數升高不明顯或在正常參考值范圍以內影響使用廣譜抗生素，等痰培養結果出來再調整用藥方案，肺部感染患者可能會因抗生素使用不當而發生不良反應，產生延誤患者病情[17]。本研究以血漿內毒素水平檢測值>0.109 EU/mL作為臨界值，血漿內毒素與痰細菌培養檢測結果比較，血漿內毒素的靈敏度和特異度分別為97.44%和83.95%，陽性預測值為94.08%，陰性預測值為93.24%,準確度為93.86%，效能較好。痰培養不能區分感染菌和定植菌，而血漿內毒素能區分感染菌和定植菌，在對患者進行初步篩選過程中表現方便、快捷，所以血漿內毒素為診斷革蘭陰性菌的有效方法。但是當人體局部或淺部革蘭陰性菌感染時，因脂多糖較少釋放入血或不入血，人體自身免疫系統能給予清除，造成血漿內毒素檢測結果出現假陰性。另外血漿內毒素檢測也會出現極低比例的假陽性結果，而導致假陽性因素有試驗器材污染，患者用藥，血清標本高溶血,高脂及高膽紅素等。因此血漿內毒素檢測結果應與臨床患者體征相聯系：①新出現的咳嗽、咳痰或原有的呼吸道癥狀加重；②發熱；③肺實變體征和(或)聞及濕啰音；④白細胞計數>10×109/L或<4×109/L,伴或不伴中性粒細胞核左移；⑤胸部X線見片狀、斑片狀浸潤性陰影或間質性改變。以上1～4項任何一項加上第5項的情況結合進行診斷和治療[17-18]。血漿內毒素隨病情惡化而升高，隨病情緩解而降低，因此血漿內毒素檢測可以作為監測病情變化的參考指標，并且還可用于指導臨床用藥和治療。內毒素鱟試驗檢測是通過酶的級聯反應，內毒素在二價陽離子參與激活C因子，然后激活其他酶原，產生一系列凝集美反應，目前應用鱟試驗陽性對肺部感染的進行診斷，血漿內毒素水平>0.109 EU/mL為定量標準，并證實它對革蘭陰性菌肺部感染患者的判斷優于痰培養[19-21]。

綜上所述，內毒素檢測具備2 h得到檢測結果，因此對于臨床肺部感染患者應動態監測血漿內毒素含量。在未得出細菌培養結果的情況下，可早期確定患者感染的細菌種類，以利于臨床合理選擇針對內毒素的抗菌藥物，而及時的治療可以避免患者發生感染加重，導致不良后果。本法快速、簡單、準確性高，可用于革蘭陰性菌的輔助診斷。