遺傳性球形紅細胞增多癥相關基因突變的研究進展

王臣玉，張耀東，張迎輝※

(1.新鄉醫學院，河南 新鄉 453003；2.河南省兒童醫院兒科，鄭州 450018)

遺傳性球形紅細胞增多癥(hereditary spherocytosis，HS)又稱先天溶血性貧血，其在世界范圍內均有發病，主要因先天性紅細胞膜骨架蛋白異常所致，目前臨床主要采用部分脾切除、脾動脈栓塞術及全脾切除治療，HS患兒常散發性就診，誤診及漏診率較高，易延誤救治時間，威脅患兒生命安全[1-3]。HS發病的分子機制是紅細胞膜骨架缺陷，導致表面積減少，并促使其發生球形改變，導致紅細胞膜彈性及機械穩定性喪失，這主要與基因突變有關[4]。HS可分為常染色體顯性遺傳和隱性遺傳，其分子遺傳學基礎具有異質性，紅細胞膜蛋白缺陷類型及基因突變類型均存在明顯差異。研究表明，SLC4A1(編碼帶3蛋白)、ANK1(編碼錨蛋白)、SPTA1(編碼α-血影蛋白)、SPTB(編碼β-血影蛋白)、EPB42(編碼4.2蛋白)等基因的突變與HS密切相關[5]。有研究顯示，帶3蛋白缺陷與錨蛋白缺陷是HS患兒紅細胞膜蛋白缺陷的主要類型[6-7]。目前關于HS相關基因突變的研究較少，現就基因突變與HS關系的研究進展進行綜述，以期為臨床診斷HS及產前優生檢查提供參考依據。

1 HS主要臨床表現及其病機

1.1主要臨床表現 HS輕度患兒無明顯癥狀，根據家族史及實驗室檢查(外周血涂片球形紅細胞計數、紅細胞滲透脆性試驗、骨髓細胞學檢查等)明確診斷；中度與重度患兒表現為貧血、黃疸、脾腫大等[8]，部分患兒合并膽囊結石，臨床表現異質性明顯，同時需與營養性貧血、自身免疫性溶血性貧血、血紅蛋白病等相鑒別。研究顯示，HS患兒發病率明顯高于臨床診出率[9]。外周血球形紅細胞增多、紅細胞滲透脆性增加、慢性貧血伴急性溶血等是HS的主要臨床特征，而球形紅細胞計數、紅細胞膜蛋白分析及基因檢測等均可用于HS的診斷[10]。HS屬于遺傳性溶血性貧血，患者臨床病理特征較為嚴重，并具有蛋白缺陷及異質性遺傳等特點，其主要臨床特征為紅細胞球型改變及滲透脆性增加等。HS新生兒出現嚴重貧血及黃疸時需接受輸血治療，甚至光療等，嬰兒期未有明顯癥狀，年長兒發病時以輕度黃疸、貧血為主要臨床癥狀，其發病原因主要為受涼感冒或過度勞累等，成年期HS以貧血、黃疸及脾腫大為主要臨床表現，外周血涂片檢測發現球形細胞和紅細胞滲透脆性增加。

1.2HS發病機制 HS的發病機制主要是紅細胞膜骨架蛋白基因突變，導致紅細胞膜網狀結構發生變化，進而促使紅細胞變為球形，由于球形紅細胞變形能力差，導致易被破壞而發生溶血性貧血。紅細胞膜的主要組成成分為蛋白質、脂質以及糖類，其中蛋白質主要由錨蛋白、膜血影蛋白、4.1蛋白、4.2蛋白等組成[11]，蛋白質主要組成蛋白發生改變可引發紅細胞膜結構改變，進而影響HS的發生。膜蛋白缺陷：①錨蛋白缺陷。編碼基因為ANK1，蛋氨酸與異亮氨酸內含子剪切位點G→A突變引起該蛋白缺陷。②血影蛋白β缺陷。編碼基因為SPTB，屬于常染色體顯性遺傳，SPTB基因突變可促使該蛋白缺失，進而引發橢圓形紅細胞增多癥。③血影蛋白α缺陷。在北歐居民中，血影蛋白α缺陷約占5%，可引發HS，呈常染色體隱性遺傳[12]。④帶3蛋白缺陷。有調查顯示，因帶3蛋白缺失導致HS的人數占HS患者的54%(162/300)，其編碼基因為SLC4A1，呈常染色體顯性遺傳，SLC4A1基因突變可促使紅細胞變為球形[13]。⑤帶4.2蛋白缺陷。因帶4.2蛋白缺失引發的HS人數較少，EPB42基因可編碼該蛋白，并呈常染色體隱性遺傳，該蛋白缺失可改變細胞膜豎向結構，進而促使紅細胞變為球形，導致溶血發生[14]。溶血機制：紅細胞膜性質改變導致變形能力下降，并促使其形態變為球形，球形紅細胞膜蛋白磷酸化功能降低，離子通透性增加，導致鈉泵作用明顯增強，繼而促使細胞膜硬化，一旦經過脾竇微血管，球形紅細胞將被滯留，進而被巨噬細胞吞噬，星兒導致血管外溶血的發生[15]。

2 HS基因突變研究

2.1SLC4A1基因

2.1.1SLC4A1基因及其編碼的帶3蛋白 SLC4A1基因位于染色體17q21，可編碼帶3蛋白。帶3蛋白主要分布在小腸上皮細胞、紅細胞及淋巴細胞中，其約占紅細胞蛋白總量的25%[16]。研究顯示，帶3蛋白具有調節糖酵解酶活性以及維持紅細胞膜骨架穩定等功能[17]。提示帶3蛋白缺失可導致紅細胞膜表面積減少，并降低紅細胞膜骨架穩定性，進而導致紅細胞變為球形。

2.1.2SLC4A1基因突變與HS 研究顯示，HS患兒及其父親均發生SLC4A1基因Arg808His位點突變，即G→AG→A突變，但DNA序列檢測發現其祖父母未發生相同突變，提示患兒父親發生Arg808His新型突變，并與帶3蛋白缺失密切相關[18]。研究顯示，SLC4A1基因內含子剪切位點50處缺失G等位基因，導致丙酮酸激酶活性降低，從而造成紅細胞ATP含量減少[19]。SLC4A1基因突變可加重HS患者血管外溶血傾向性。通過對HS患兒進行基因測序發現，SLC4A1基因14號外顯子1885-1888處發生CCGG重復雜合子突變，其直接導致移碼突變，進而促使其成為不穩定蛋白，并喪失正常功能[20]。相關研究發現，HS患兒發生新型雜合子突變并存在SLC4A1基因13號外顯子單核苷酸GAG→AAG(Glu508Lys)突變，其父母不是HS患者且均不存在此突變[21]，分析可能是生殖細胞減數分裂末期產生的新型突變，其中Glu508Lys位于帶3蛋白的跨膜區，這可能導致患兒帶3蛋白功能發生改變。

SLC4A1等位基因的突變形式具有多樣性，HS常見致病原因為SLC4A1雜合突變，其主要發生在帶3蛋白胞質和跨膜區，而SLC4A1基因雜合突變促使帶3蛋白減少20%～30%[22]。同一家族中SLC4A1基因雜合突變交叉互換后，各家族成員間可能存在不同表現形式[22]。SLC4A1基因編碼的帶3蛋白Coimbra突變屬于純合突變。有調查顯示，1例HS患兒母親前兩胎均于宮內早期死亡，隨后跟蹤調查患兒母親第3次孕期，抽取懷孕時患兒心包積液及腹水進行分析發現，患兒紅細胞呈多樣性且脆性極高，探究其原因發現，SLC4A1基因純合突變導致帶3蛋白缺失，進而促使上述現象發生[23]。以上研究表明，無論SLC4A1基因發生雜合突變還是純合突變均可引發帶3蛋白缺失，進而促使紅細胞變形，導致HS發生。

2.2ANK1基因

2.2.1ANK1基因及其編碼錨蛋白 ANK1基因位于人染色體8p11.2，主要在紅細胞膜中表達，并連接陰離子通道和收縮蛋白等。ANK1編碼基因序列中5′端215 bp是具有啟動子活性的基因片段，并可激活紅細胞錨蛋白，具有一定的特異性[24]。ANK1基因可編碼錨蛋白，而錨蛋白62 000結構域含有收縮蛋白結合肽，其能夠與β-收縮蛋白磷酸化后的錨蛋白上的位點結合，進而維持紅細胞形態，55 000結構域能調節帶3蛋白的功能，若錨蛋白合成減少導致膜上的錨蛋白組裝及異常組裝錨蛋白生成量減少，錨蛋白缺失可減弱成膜骨架與脂質雙分子層間垂直方向的相互作用，進而降低脂質雙分子層穩定性，其中脂質還可變為囊泡而丟失，進而減少紅細胞膜表面積，最終導致紅細胞變為球形[25]。以上提示錨蛋白與帶3蛋白可相互作用，并在紅細胞結構及形態維持中發揮重要作用。由此可知，在錨蛋白合并收縮蛋白缺陷型HS中，錨蛋白缺陷是主要病因，究其主要原因為ANK1基因突變引發錨蛋白缺陷，進而造成膜收縮蛋白缺陷，錨蛋白與帶3蛋白無法正常連接導致收縮蛋白丟失。

2.2.2ANK1基因突變與HS ANK1基因突變引發的HS主要為顯性遺傳，突變類型主要為無義突變、移碼突變及剪接突變，其中無義突變可降解信使RNA，進而增加錨蛋白轉錄的不穩定性。在部分無義突變導致的HS患兒中，正常等位基因異常高表達時可代償性彌補錨蛋白缺陷，從而影響HS的嚴重程度[26]。臨床數據顯示，HS顯性遺傳患者中，錨蛋白合并收縮蛋白缺陷者病情較輕；在HS隱性遺傳者中，錨蛋白合并收縮蛋白缺陷者病情較為嚴重，甚至危及生命[27]。HS相關ANK1基因突變體還包括Marburg等移碼突變錨蛋白[28]。有研究指出，錨蛋白缺陷的隱性HS患兒中ANK1基因啟動子序列存在明顯變化，啟動子發生突變致使轉錄因子結合位點破壞，從而導致錨蛋白合成減少，此外ANK1基因啟動子突變主要包括108T→C、153G→A等[29]。無論是常染色體顯性遺傳還是隱性遺傳，ANK1基因突變可降低錨蛋白的合成，進而影響HS的發生及發展。

研究顯示，HS患者ANK1基因16號內含子中發生G→A突變，引發外顯子上游序列改變，進而產生新型受體剪接位點，而新型突變型錨蛋白Ankara與ANK1基因異常剪接密切相關[30]。ANK1基因新生突變常出現在母體生殖細胞中，研究表明，HS患兒體內出現ANK1基因新型雜合子無義突變，ANK1基因1號外顯子單核苷酸發生G→T突變，而患兒父母均不存在此突變，其可能是在生殖細胞前體分化過程中形成的新生突變，患兒發生嚴重溶血及貧血[31]。研究表明，ANK1基因33號外顯子L1340p T→C突變與特定HS類型有關，經研究證實該位點基因突變為該患兒發病的分子基礎[32]。研究發現，ANK1基因c.399位點T→G突變可能是兒童HS的致病基因[26]。目前關于HS相關基因的研究相對較少，ANK1基因突變與HS發病機制的關系及其具體作用機制可作為研究重點，為臨床遺傳咨詢及產前診斷提供參考。

2.3HS其他相關基因 HS相關基因還包括EPB42、SPTB、SPTA1，其中EPB42基因位于人染色體15q15～q21，編碼的4.2蛋白含721個氨基酸，并可與錨蛋白、帶3蛋白結合，與細胞膜內表面相連接，且較為穩定，同時還與膜骨架網架連接，是脂質雙分子層與膜骨架之間必不可少的紐帶之一[13]。目前研究發現，EPB42基因存在兩個單核苷酸多態性，即c.329位點C→T和c.2997位點G→A，經檢測證實患兒母親也存在c.329位點C→T突變[33]。一項韓國的家庭病例報道顯示，母親患有HS，其第三個兒子及其兩個孫子也患有HS，基因檢測發現，SPTB基因新型無義突變是導致這一現象的根本原因[34]。關于HS的其他相關基因及其是否存在HS致病基因突變均需進行多方面驗證，根據臨床表型及基因遺傳方式確定其中具體關系。

3 HS診斷

HS診斷主要分為典型HS診斷與非典型HS診斷，其中典型HS診斷主要依據外周血涂片，濃染細胞增加較球形紅細胞增加較多是HS診斷金標準之一[35]。紅細胞滲透脆性試驗、酸化甘油溶解試驗易受多種因素影響而降低了診斷效能。由于非典型HS患兒臨床表現輕微甚至無癥狀，因而血涂片不能有效診斷，伊紅-5′-馬來酰亞胺集合試驗可有效診斷，且具有較高的靈敏度和特異性，其主要采用流式細胞儀檢測熒光強度以判斷是否患有HS，伊紅-5′-馬來酰亞胺集合試驗還可用于診斷遺傳性熱異形細胞增多癥和遺傳性口形紅細胞增多癥，新生兒未能有效獲得病理診斷時不可否定HS的診斷，需在6月齡后進行相關檢查[36]。

實驗室檢測HS時還可采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測α/β血影蛋白、錨蛋白、帶3蛋白及帶4.2蛋白等的相對表達量，但檢測結果準確性較低，同時帶3蛋白及帶4.2蛋白降低又可影響α/β血影蛋白、錨蛋白電泳條帶含量[13]。對分子生物學基因的研究有助于提高HS患兒的診斷率。基于既往研究，現代研究采取膜蛋白基因突變分析鑒定基因突變，此方法可有效辨別原發或繼發基因缺陷甚至新生突變，采用限制性片段長度多態性連鎖分析等分子生物技術可確定HS疾病進展與某個基因的關聯性，進一步采用實時熒光定量聚合酶鏈反應、聚合酶鏈反應一單鏈構象多態性分析等方法可鑒定膜蛋白基因突變位點，變性高效液相色譜分析可直接檢測出單核苷酸變異，其具有靈敏度高、效率高等優點，但膜蛋白基因突變分析技術耗時且費用較高，因而尚未普及應用。

4 小 結

HS作為遺傳性紅細胞膜缺陷病，探尋診斷HS的決定性指標對提高診斷準確率及治療效果均具有重要意義。分子生物學指標可用于HS的診斷，其致病相關基因主要有SLC4A1、ANK1、EPB42、SPTB、SPTA1，其中SLC4A1、ANK1基因突變與HS發生最為緊密，由于不同種族或地區HS致病基因及膜蛋白缺陷類型存在明顯差異，因而需進一步探索并建立適合本地區HS患兒紅細胞膜蛋白分析及基因診斷的方法，以期為HS診療及優生優育的產前診斷提供支撐依據。