時鐘基因Bmal1在腦缺血再灌注損傷中的作用

袁 泉，趙 博，劉 戀，黎 梅，王雅楓，夏中元

(武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060)

生物的晝夜節律是生物體適應周期性環境變化的先天性能力。晝夜節律能夠通過重置自己的節律適應不斷變化的環境[1]，但晝夜節律的長時間中斷也會對大腦的生理和生物學行為產生負面影響，甚至可能會導致代謝和心臟生理功能紊亂，最終導致腦血管事件[2]。事實上，一日內腦卒中事件的發生率在不同時間點也具有差異性。盡管全天都有可能發生腦缺血事件，但研究表明，卒中的發生率在早上6點至下午2點增加，特別是患者清醒后的2 h內；而在午夜至早上6點降低[2]。由此可見，生物的晝夜節律不僅影響著正常的生理活動，而且對病理性改變也有影響。在哺乳動物晝夜節律的核心負反饋環中，Bmal1-Clock復合體是關鍵的調控元件，其與Period(Per)基因上的E-box結合驅動的轉錄激活和抑制是哺乳動物內源性晝夜節律性的主要基礎[3]。現就時鐘基因Bmal1在腦缺血再灌注損傷中的作用及其機制進行討論。

1 時鐘基因Bmal1

生物鐘是由各種起調控作用的信號分子和自動調節反饋生理活動的各種回路共同作用形成的[4-5]。Bmal1-Clock復合體通過結合Per基因上的E-box啟動子，激活Per和Cryptochrome(Cry)兩個時鐘基因的轉錄。反過來Per-Cry復合體也會抑制Bmal1-Clock復合體的活性，從而關閉負反饋環[5-7]，這一過程發生在晝夜節律的主觀白晝，也就是說在主觀白晝，Bmal1的表達量是減少的；而在主觀夜晚期間，Cry的降解可重新激活Bmal1-Clock復合體，并重新啟動Cry和Per轉錄[8]。說明Bmal1轉錄翻譯的震蕩在晝夜節律的形成中起重要作用。

研究表明，Bmal1存在多種形式的翻譯后修飾，而這些調控對其功能轉變起重要作用[9]。Bmal1是SUMO(small ubiquitin-like modifier)化的底物，而這種修飾在生物鐘振蕩現象的形成中不可或缺[10]。研究證實，Bmal1也存在泛素化，并且Bmal1-Clock的活性與Bmal1泛素化的水平密切相關；Bmal1的磷酸化圖譜表現出強烈的晝夜節律[11-12]；Bmal1的乙酰化也存在節律性，研究表明，組蛋白去乙酰化蛋白家族的活性也存在一定的節律性，并受煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙酰化酶(sirtuin)家族的調控，而sirtuin家族與Clock結合并被招募到Clock-Bmal1染色質復合物上，導致Bmal1的Lys9/Lys14位點被節律性地乙酰化，從而引起下游一系列級聯反應[13]。以上研究表明，Bmal1受到多種形式的修飾，從而引起一系列重要的晝夜節律性改變，與生物體晝夜節律的形成密切相關。Bmal1也影響著生物體內從代謝到細胞程序性死亡等多種重要的生理病理過程。

腦缺血損傷狀態下，生物體的晝夜節律發生紊亂，會失去其原有節律。在分子水平，時鐘基因的轉錄水平、翻譯后修飾水平的正常節律會發生變化[14]，而這些變化又會進一步引起病理性變化。

2 Bmal1與腦缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷發生在組織血供被阻斷后再次恢復血供的各種臨床醫療環境中，如突發疾病(如心肌梗死、腦卒中)、擇期手術(如移植、血管手術或應用止血帶的手術)等。世界范圍內，急性缺血性腦卒中因腦血流量減少而導致腦功能喪失是致殘和致死的主要原因之一，經治療血運重建后可能會出現嚴重的并發癥，而缺血再灌注損傷便是其中之一。研究人員觀察腦卒中發生率時間變異性的同時發現，在Zeitgeber time(ZT)18時，時鐘蛋白PerⅠ、Clock、Bmal1的表達量顯著增加，腦卒中發生率降低與Bmal表達量增加這兩個事件在時間上有重合[2]。另有研究表明，與正常腦組織相比，發生缺血再灌注損傷的腦組織時鐘基因Bmal1表達的晝夜節律及轉錄、翻譯后修飾水平發生了變化[14]，這種缺血區與非缺血區之間生物鐘節律的不同步性會加劇腦缺血的發生和發展[15]。

腦缺血再灌注損傷的病理生理機制包括興奮性毒性神經遞質的釋放、細胞內Ca2+的積累、自由基損傷、神經元凋亡、神經炎癥以及脂解作用[16-22]。Bmal1是通過何種途徑影響腦缺血再灌注損傷過程中的哪一環節仍在研究中。從目前的研究成果來看，Bmal1不僅僅作用于腦缺血再灌注損傷中的某一單一機制，而是多重影響腦缺血再灌注損傷的結果，并且損傷機制也會影響Bmal1的轉錄和翻譯。

2.1Bmal1與氧化應激 在腦缺血再灌注損傷復雜的病理生理機制中，自由基學說起到了關鍵作用。自由基分為活性氧類和活性氮兩大類。氧自由基過量導致的氧化應激在腦缺血再灌注損傷中有重要作用。在組織缺血再灌注過程中有4種途徑可以產生過量的氧自由基：線粒體呼吸鏈，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化過程，環加氧酶2催化的花生四烯酸反應，黃嘌呤和次黃嘌呤氧化過程[23]。過量的氧自由基可引起氧化應激并造成DNA損傷、脂質過氧化以及蛋白質結構和功能的改變，從而導致細胞死亡。雖然大腦僅占人體體重的2%，但腦組織耗氧量占人體總耗氧量的20%，故產生的自由基遠多于其他器官。此外，腦組織含有大量脂質、不飽和脂肪酸以及高水平的鐵離子[24]，因此大腦更易受氧自由基的損傷[25-26]。另外，活性氧類還可以調控細胞凋亡和壞死的信號通路，如p53和Bcl-2家族蛋白(Bax、Bid以及p53上調凋亡調節因子)等；調節細胞死亡的促分裂原活化的蛋白激酶通路也受活性氧類的調節[27-28]。綜上，氧化應激是腦缺血再灌注損傷的重要機制之一。

氧化應激受時鐘基因Bmal1的調控。研究發現，晝夜節律蛋白Bmal1及其二聚化伴侶Clock通過控制活性氧類的產生和氧化應激參與組織穩態的調控[28-30]。Bmal1轉錄水平下降會導致超氧自由基生成增加[31]。在缺血性腦卒中中活性氧類的表達水平升高，低氧誘導因子1α蛋白活化，對神經元起保護作用，而Bmal1和Clock的過表達可導致在ZT18時低氧誘導因子1α被直接或間接激活，提示Bmal1可能直接或間接調控機體內的氧化應激[32]。Khapre等[28]研究發現，Bmal1-/-小鼠腎臟中活性氧類的水平升高，在心臟和脾臟中活性氧類的水平也隨著時間的推移而逐漸升高。給予抗氧化劑(N-乙酰-L-半胱氨酸)后，Bmal1-/-小鼠臟器內的氧化應激水平降低[33]。更有研究指出，Bmal1可調節大腦中氧化還原基因的表達，從而調控組織中氧化應激的水平[28]。

神經元的氧化應激會導致神經元細胞死亡和星形膠質細胞變性。在小鼠原代神經元中，抑制Bmal1的表達與用化學誘導劑誘導氧化損傷都會促使神經元死亡和紋狀體神經變性；而Bmal1缺失會導致突觸末梢受損變性，進而導致皮質連接功能受損以及神經元氧化應激損傷加重，并誘導氧化還原防御基因的表達[9,33]。但在缺乏Per1和Per2的小鼠的大腦中并未觀察到星形膠質細胞的增生[34]。在果蠅中，Per基因的缺失加劇了腦組織的神經變性[35]。盡管Per已被證明可以促進Bmal1-Cry的相互作用，但敲除Per基因后，Cry依舊能有效抑制Bmal1的轉錄[34,36]。所以在Per-Cry復合體中，Cry被認為是主要的阻遏物。因此，之前提及的研究只能表明Bmal1對機體氧化應激水平的調控不受Per的影響，但并不能表明Bmal1與機體氧化應激水平的調控和生物節律沒有關系。因此，有關Cry對Bmal1蛋白功能的影響以及氧化應激的晝夜節律還需進一步研究。

2.2Bmal1與血管內皮功能障礙及微血管重塑 血管功能障礙是很多心腦血管疾病的發病基礎。雖然氧化應激在機體內普遍存在，但血管內皮NO依賴性血管舒張功能下降可導致內皮細胞更易受氧自由基的損害。NO由內皮細胞產生并釋放，但去向取決于氧自由基，如超氧化物(O2-)易與NO結合[37]。這種“清除”作用減少了可用于引起平滑肌細胞松弛的NO的量，導致NO依賴性血管舒張功能受損。因此，氧化應激被認為是降低NO生物利用度以及促進內皮功能障礙發展的主要原因。NO由谷氨酸代謝生成，在糖尿病患者體內會逐漸累積，并在視網膜毛細血管變性中起重要作用；其次在超氧化物的存在下，NO會迅速形成強氧化劑——過氧亞硝酸鹽，其與蛋白質快速作用，導致硝基酪氨酸形成[38]。來自Bmal1flox/flox; Tek-Cre小鼠(Bmal1特異性敲除的內皮細胞表達特異性受體酪氨酸激酶的工具鼠)視網膜缺血再灌注損傷模型的視網膜樣本顯示，硝基酪氨酸強烈染色，提示NO信號在介導缺血再灌注損傷中起關鍵作用[39]。研究表明，Bmal1敲除小鼠存在內皮功能障礙，與正常小鼠相比，Bmal1基因敲除小鼠對乙酰膽堿及NO依賴性血管舒張反應的能力嚴重受損，更重要的是，Bmal1基因敲除小鼠的血管會發生病理性重塑，在缺血情況下，血管損傷會增加[40]。推測NO與Bmal1之間形成了調控環路[40]。

細胞衰老可能參與血管內皮功能障礙和心腦血管疾病的病理生理過程。研究顯示，腦細胞衰老與血管內皮功能障礙的發生具有一定的聯系，其機制可能與機體氧化應激反應增加、間充質干細胞增殖分化異常等相關[34]。在缺血再灌注臟器中，活性氧類的聚集以及脂質代謝異常等促進正常細胞進入衰老程序，即應激誘導性衰老，從而喪失正常的結構和生理功能。因而，清除氧自由基、恢復氧化還原反應平衡能減少血管內皮功能障礙的發生，減輕灌注損傷和衰老等疾病的發生。研究表明，Bmal1-/-小鼠不僅表現出生物鐘節律紊亂，還存在早衰現象，表現為局部神經細胞功能退化及連接功能喪失，具有激活炎癥和損傷的特征，同時還表現出異常血管重塑，增加了老年動物頸動脈血栓形成的易感性[41]。下調內皮細胞中Bmal1的水平促進了微血管和大血管的損傷，導致微血管重塑與新生內皮增加[31]。研究者在Bmal1基因敲除的缺血再灌注模型小鼠的視網膜無細胞毛細血管中觀察到，無細胞毛細血管的數量較野生型小鼠增加了3倍，表明Bmal1-/-小鼠的微血管增生重塑大幅上升。同樣的，與股動脈損傷的野生型小鼠相比，Bmal1-/-小鼠損傷的股動脈新生內皮增生增加20%[39]。更有研究進一步表明，Bmal1可能是通過抑制單核細胞的聚集，來減輕血管內皮的炎性損傷以及動脈粥樣硬化[42]。

2.3Bmal1與興奮性神經遞質 谷氨酸鹽是主要的興奮性氨基酸，能激活多種信號轉導的級聯反應。該神經遞質參與晝夜節律的光誘導作用，從而調節人類的生理和行為功能。研究人員用谷氨酸能配體刺激雞小腦Bergmann神經膠質細胞的原代培養物發現，Bmal1的水平呈劑量-時間依賴性增加[43]。此外，在谷氨酸刺激下，Bmal1中絲氨酸殘基的磷酸化增加[43]。Bmal1表達的增加很可能是環腺苷酸依賴性蛋白激酶和(或)Ca2+/二酰基甘油依賴性蛋白激酶磷酸化后穩定化的結果[11]。目前認為，谷氨酸參與調節神經膠質細胞中Bmal1的表達，而這些細胞可能在控制小腦的晝夜節律中起重要作用。有學者用神經遞質谷氨酸100 μmol/L、5-羥色胺10 μmol/L以及多巴胺10 μmol/L同時處理星形膠質細胞，導致Bmal1的表達增加[44]。以上研究提示，腦缺血再灌注損傷時釋放的神經遞質可誘導Bmal1表達，并調節翻譯后修飾。

2.4Bmal1與神經元的凋亡及自噬 Bmal1通過調控活性氧類的水平影響細胞凋亡和壞死信號通路，p53、Bcl-2家族蛋白(Bax、Bid)、促分裂原活化的蛋白激酶通路都是活性氧類誘導細胞死亡的關鍵通路[27,45]。有證據表明，與其他時間點誘導的缺血相比，午夜(ZT18; 24:00)誘導的小鼠腦缺血再灌注損傷梗死體積少、腦腫脹輕、神經功能缺損評分低、神經元存活率高、凋亡細胞少[46]，而這可能與晝夜節律蛋白Bmal1表達的增加有關。

自噬是細胞內自我降解的過程，自噬體與溶酶體融合后降解自噬體內過量或受損的細胞器和細胞質。雖然自噬通常被認為是促進細胞存活的，但其也在細胞死亡過程中起作用。有研究報道認為，缺乏生物鐘蛋白的小鼠對腦缺血有更高的易感性[39-40]，進一步研究發現，這一現象與生物鐘基因依賴性調節凋亡/自噬標志物的表達有關[47]。

3 結 語

氧化應激是導致腦缺血再灌注損傷的重要機制，而Bmal1也被證實在氧化應激水平的調節中起重要作用，因此推測Bmal1對腦缺血再灌注損傷也有一定的影響。Bmal1作為時鐘基因負反饋環中的關鍵調控元件，也調控著機體內的氧化應激水平、血管功能障礙以及血管重塑水平等，從而調控腦缺血再灌注損傷的發生、發展及預后。相對地，腦缺血再灌注損傷也可影響組織自身生物鐘節律的改變，兩者以類似于正反饋的形式相互作用。目前對于Bmal1具體是通過何種信號通路調控氧化應激水平的尚未有定論。未來，生物鐘可作為一個新的治療靶點，通過調節生物鐘或其中某一重要環節如Bmal1-Clock復合體，減少腦組織缺血再灌注損傷，并對損傷起到一定修復作用。