錯配修復缺陷與結直腸癌關系的研究進展

孫 田，柳青峰，肖明明，臧 輝，梁 靜

(1.中國醫科大學研究生院，沈陽 110122； 2.遼寧省人民醫院普外科，沈陽 110016；3.遼寧省人民醫院病理科，沈陽 110016)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上第三大常見的惡性腫瘤[1]和第二大癌癥死亡原因[2]，也是排名前十的影響全球公共衛生健康的疾病。據統計[3]，目前CRC的全球總病例數約為180.5萬，其發病率和死亡率在世界范圍內差異較大。在許多中-高人類發展指數的國家(亞洲、南美洲等)，CRC的發病率和死亡率呈升高趨勢，相比之下，在最高人類發展指數國家卻保持穩定或下降趨勢，這種差異與早期篩查和醫療改善的相關性較大。Austin等[4]發現高年齡組(50歲或以上)CRC的發病率下降，但年輕組(50歲以下)上升，差異可能與遺傳風險因素富集有關[5]。據我國2015年流行病學的統計數據顯示[6]，CRC的發病率和死亡率均排名所有惡性腫瘤的第五位，男、女性的發病率和死亡率也位居前列，CRC新發總例數為37.63萬，死亡總例數為19.10萬，城市的發病率高于農村。伴隨著人口基數大、地域形式多樣和文化信仰不同等問題，我國癌癥防治措施有待進一步加強。

CRC是一種復雜的異質性疾病，多種因素影響病情的發生、發展和轉歸。CRC可因遺傳和非遺傳因素的影響而發病，因遺傳因素而引起的CRC可分為家族性腺瘤性息肉病、遺傳性非息肉性CRC等類型，由非遺傳性因素即僅影響單個細胞及其后代引起的CRC稱為散發性CRC[7]。調查顯示，高達35%的CRC與遺傳因素相關[5]，且年齡是主要的危險因素[8]。人體內存在多種機制維持遺傳物質的穩定，其中一種稱為DNA錯配修復(mismatch repair，MMR)，MMR過程需要多種蛋白質的參與，它們可以在DNA復制后修復錯誤位點，維持DNA的高度保真性，進而減少基因突變。MMR缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)與多種惡性腫瘤存在明顯的相關性,如CRC、子宮內膜癌、乳腺癌等，并且MMR在CRC的診斷和治療過程中也發揮重要作用[9-12]。隨著病理分子學和基因學等技術的發展，CRC的診斷和治療水平有了很大提高，使醫師有了更準確的診治方式，也使患者獲得了更好的治療效果，MMR在CRC中有廣闊的應用前景。現就dMMR與CRC的相關研究進展進行綜述。

1 dMMR概述

1.1發生發展及產生機制 MMR是一種高度保守的細胞過程[12]，其中涉及多種蛋白質，并在DNA復制過程中起重要作用。DNA的MMR基因最早在原核生物中被發現，作用于細胞內，負責在DNA復制后對堿基進行MMR，另外也可以修復一些小的核苷酸插入或缺失，而后其相關基因也在人類細胞和酵母菌中被發現[13]。MMR的關鍵基因包括MutL同源物1(Mult homolog 1，MLH1)、MutS同源物2(Mult homolog 2，MSH2)、MSH6和減數分裂后分離增加2(postmeiotic segregation increased 2，PMS2)等。已有研究證實，MMR基因在雙鏈斷裂修復，細胞凋亡和重組中發揮作用[14]。MMR基因表達產物稱為MMR蛋白，在DNA復制、遺傳物質重組和化學或物理損傷過程中以異二聚體復合物的形式存在，進行錯配堿基的鑒定及其后續修復[15]。這些復合物包括MutSα(MSH2蛋白與MSH6蛋白組合)、MutLβ(MLH1蛋白與PMS1蛋白組合)、MutSβ(MSH2蛋白與MSH3蛋白組合)和MutLα(MLH1蛋白與PMS2蛋白組合)。在DNA復制發生錯配后，首先MutSα識別并結合DNA鏈，招募MutLα，經構象改變后，從錯誤位點釋放，隨后招募核酸外切酶-1切除錯配區域，復制因子A穩定單鏈DNA，由DNA聚合酶Polδ和增殖細胞核抗原形成的復合物填補空缺，最后由DNA連接酶修復缺口[1-2,14]。有研究證實[12]，MMR使DNA復制的準確性提高了100～1 000倍。若MMR基因或蛋白功能缺陷，DNA復制錯誤得不到修正，錯誤的逐漸積累加劇基因的變異，進而產生dMMR表型。總之，dMMR可以通過3種主要機制[16]發生：①體細胞MMR基因的高度甲基化，最常見的是MLH1缺陷；②以Lynch綜合征為代表的MMR基因的遺傳種系突變；③MMR基因中存在的雙體細胞突變，并且dMMR腫瘤也會表現一定的組織病理學特征[7]，包括增加的腫瘤浸潤淋巴細胞，克羅恩樣腫瘤周圍淋巴細胞反應，黏液/印戒細胞分化和髓質分化等。dMMR使DNA復制錯誤積累，增加染色體重排和基因變異，是CRC發生、發展的一種重要機制。

1.2免疫組織化學檢測 免疫組織化學檢測常用于評估MMR蛋白(包括MLH1，MSH2，MSH6和PMS2蛋白)的表達情況。根據MMR蛋白的表達情況可將其分為兩種類型[17]：若一種或多種MMR蛋白表達缺失稱為dMMR，無缺失稱為正常的MMR(proficient mismatch repair，pMMR)。免疫組織化學檢測具有技術簡便、操作易行、成本低，且敏感性和特異性與基因檢測相仿等優點，如Lu和Sheng[18]研究發現，免疫組織化學檢測對MLH1和MSH2突變的靈敏度為79%～95%，但其不能檢測出種系突變，查明突變的具體位置，這就需要聚合酶鏈反應等相關檢測進行確認。對其檢測的結果來說，實際情況有所不同，因為MMR蛋白具有異二聚體的性質，蛋白質的表達喪失又有可能是其配對蛋白質表達喪失的結果。如單獨PMS2或MSH6蛋白丟失可表明其存在缺陷，但當MLH1和PMS2蛋白均表達喪失時，可能僅僅是因為MLH1的喪失使PMS2不穩定而導致的。MSH6和MSH2同樣如此。另外，免疫組織化學檢測的染色結果也會有異常的情況出現，如染色不完整，或呈灶狀，但未完全缺失，染色位于細胞質而非細胞核等，這可能與核定位序列的缺失、實際使用固定劑的差異或組織固定均勻性的不同等因素相關[14]。因此，實際工作中檢測結果的評估有待進一步探究。總之，免疫組織化學檢測優勢明顯，符合現狀，可用于評估MMR狀態，篩選試驗或臨床分析試驗，在臨床上已廣泛應用。

2 dMMR CRC的臨床特征及預后

dMMR是人類發現的一種重要的CRC致病機制，并為研究CRC的發生、發展提供了重要的線索和依據。約15%的CRC與dMMR相關[17,19]。MMR狀態不同的CRC在年齡、TN分期和性別等特征上有所不同。如高度微衛星不穩定(microsatellite instability-high,MSI-H)的dMMR CRC患者顯示出一定的臨床特征[17,20]，包括多見于女性，近端腫瘤位置，分化差的黏液表型等，并且dMMR是Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者預后良好的標志物，這些特征與pMMR患者存在明顯的差異性，在腫瘤微環境上也是如此，應用dMMR腫瘤微環境的相關特性可為患者的預后提供參考依據。dMMR CRC與非轉移性患者較高的中性粒細胞計數、中性粒細胞/淋巴細胞比率和C反應蛋白水平相關，但中性粒細胞/淋巴細胞比率僅在pMMR CRC中具有預后價值[21]。此外，因為dMMR CRC遺傳物質穩定性低，可使部分腫瘤基因失活，若失活位點為轉移所必需，那么會在一定程度上改善患者的預后。Yan等[17]臨床研究表明，在近端結腸癌和直腸癌中，pMMR患者更傾向于晚期并且淋巴結轉移，原因可能是dMMR導致重組人轉化生長因子-β受體2基因突變失活，使腫瘤細胞不易發生上皮-間充質轉化過程，而該過程是轉移中的關鍵事件[21-22]。但有研究得到相反的結論，Goldstein等[23]證實，BRAF V600E突變是MSI-H dMMR轉移性CRC的不良預后因素，常見于Ⅳ期CRC患者(41%)，雖然這部分患者存在MSI-H，但生存期不能明顯延長，相反，pMMR是延長無進展生存期和總生存期的獨立因素[17]。因此，對于轉移性和非轉移性患者相關結論不能等同替換，需要更多的樣本及數據進行研究。

目前，腸道微生物組與MMR CRC之間已建立一定的聯系，并且在CRC的診斷、預防和治療中表現出良好的應用前景。Hale等[24]將腫瘤生物學和微生物生態學結合在一起研究CRC后發現，相比于pMMR CRC，脆弱擬桿菌和硫化原球菌梭狀核在dMMR CRC中顯著富集，并證實dMMR和pMMR CRC微生物群落的影響網絡之間的差異僅與腫瘤或正常相鄰的微生物群有關，再次強調了將MMR狀態加入CRC微生物組研究的重要性[25-26]，這些發現為今后CRC的研究及診療提供了新思路和新手段。

2.1dMMR與Lynch綜合征、Lynch樣綜合征 約3%的CRC患者由MMR基因(MLH1，PMS2，MSH2和MSH6中一種或多種)發生種系突變造成，被稱為Lynch綜合征相關CRC,又可稱為遺傳性非息肉性CRC。Lynch綜合征是最常見的遺傳性CRC易感綜合征[5]，屬于常染色體顯性遺傳病，具有較高的外顯率，Lynch綜合征患者發生CRC的風險高于一般人群，其終生累積發病率高達80%[27]，并且也增加了患其他類型癌癥的風險，如子宮內膜癌、卵巢癌和胃癌等。Lynch綜合征的存在依據是微衛星不穩定的存在和(或)通過免疫組織化學確定缺乏MMR蛋白的表達，以及在DNA MMR基因中存在有害的種系突變。MLH1或MSH2的突變占所有Lynch綜合征相關癌癥的60%～80%，其他病例可歸因于MSH6或PMS2突變[28]。PMS2突變與Lynch綜合征的特殊表型[9]相關，即患者的發病年齡較大，常無相關家族病史，腸鏡見結腸息肉較多等。Ligtenberg等[19]研究發現一種特殊類型，即上皮細胞黏附分子基因(緊鄰MSH2的上游)刪除其終止密碼子導致甲基化，而誘導的MSH2基因沉默，形成Lynch綜合征，其比例小于5%[5]，而Richman[14]證明，上皮細胞黏附分子種系突變的存在與其表達缺失之間存在高度特異性，并建議在MSH2陰性腫瘤患者中加入相關檢測。總之，這些差異凸顯了MMR不同基因之間的可變外顯率以及基因癌癥風險評估的重要性。目前，Lynch綜合征相關CRC的診斷標準依據的是阿姆斯特丹Ⅱ標準和修訂的Bethesda標準[22]。早期篩查CRC患者是否因Lynch綜合征引起已為醫療人員所認可，而Lynch綜合征的通用腫瘤篩查也是在CRC上進行的，用以早期確定原因不明的MLH1甲基化和種系突變的dMMR患者[10]，但對于Lynch綜合征的攜帶者，因沒有特征性的臨床表型，尤其是沒有癌癥家族史的患者，目前沒有較好的篩查方法[29]。因此，對于Lynch綜合征患者家屬更需要遺傳物質鑒定和篩查，以達到早期預防和治療的目的。

特別需要說明的是，有關臨床研究也發現，沒有MMR基因(包括MLH1，PMS2，MSH2和MSH6)種系突變的dMMR約占Lynch綜合征總數的70%[8]，并應用Lynch樣綜合征來提及不明原因的腫瘤dMMR現象[10]。在發病機制上，多數Lynch樣綜合征患者出現MMR基因的雙等位基因失活[30]，其突變率相對較低，并且可以在一定程度上解釋，與Lynch綜合征患者相比，Lynch樣綜合征患者的一級親屬患CRC和其他癌癥的風險較低[31]。在臨床病理特征上，Lynch綜合征和Lynch樣綜合征的CRC患者的平均發病年齡接近(48.5歲比53.7歲),重要的區別特征在于CRC較低的標準化發病率(6.04%比2.12%)[32]，臨床研究發現前者更容易發生于左半結腸和直腸，后者更易發生于右半結腸[10]。目前對于Lynch樣綜合征和Lynch綜合征患者，未解答的關鍵問題是遺傳特性的風險評估和管理的不確定性，在無癌個體中識別相關患者以及如何利用其獨特的免疫生物學特性進一步治療是今后的研究中面臨巨大的挑戰。

2.2dMMR與散發性CRC 大多數dMMR CRC由MLH1基因啟動子區的異常甲基化引起[11]，即引起散發性CRC。在免疫組織化學證實MLH1缺失的患者中，約75%為散發性，且散發性MSI-H CRC占所有CRC的3%～15%[20]。反過來，MLH1啟動子的高甲基化在散發性CRC的發生發展中起重要作用，這種機制造成了MLH1基因蛋白的表觀遺傳損失，與體細胞的BRAF基因的密碼子600(V600E)突變有關[27]，也有學者將其稱為高CpG島甲基化表型，并可導致抑癌基因失活。CpG島甲基化表型的腫瘤也具有一定的臨床特征[25]，如通常位于近端結腸，具有BRAF基因突變，并且由無柄鋸齒狀腺瘤引起。但在一小部分MSI-H CRC中也觀察到MLH1甲基化和CpG島甲基化表型狀態之間的不一致性[20]，這些差異表現出散發性CRC發病機制的復雜性，且臨床病理特征的研究結果也不同,散發性CRC的致病機制復雜，表型多樣，其與dMMR的相關研究有望為dMMR CRC的診斷和治療提供更有意義的依據。

3 dMMR 與CRC的治療

3.1化療 對于CRC目前主張多學科的綜合治療，其中基于氟尿嘧啶的輔助化療已被證實能夠減少復發及延長生存期，特別是Ⅲ期患者[33]。目前更多的研究認為，與低度微衛星不穩定和微衛星穩定CRC患者相比，MSI-H CRC患者輔助化療的有益效果更少或沒有效果[26]。André等[33]在奧沙利鉑/5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣的結腸癌輔助治療的多中心國際研究(MOSAIC)中發現，對Ⅱ期或Ⅲ期CRC患者，在5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸方案中添加奧沙利鉑可顯著改善5年無病生存期和6年總體生存率，且更應在Ⅲ期患者手術后給予[14]。然而，Alex等[34]研究762例轉移性CRC患者后證實，dMMR表型對奧沙利鉑化療具有耐藥性，且這種性質在散發性dMMR表型中更為明顯。同樣，Ostwal等[35]在包含419例的局部中晚期直腸癌患者的治療研究中發現，296例具有dMMR的患者，以基于5-氟尿嘧啶，同時添加奧沙利鉑的化療作為新輔助治療手段相對缺乏益處。重要的是，該研究可能排除了在晚期直腸癌患者中使用抗dMMR療法，而這反過來可指導抗pMMR療法的研發。總之，對CRC輔助治療，dMMR對未轉移患者治療效果的預測具有一定的價值。目前不能僅憑MMR狀態來評估個體輔助治療效果，基因變異等特殊因素也應考慮在內，這就需要通過多中心、大樣本的臨床隨機對照試驗為個體化的綜合治療策略提供依據。

3.2免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)治療 ICIs治療已成為抗癌研究的熱點,研究者已經在腎細胞癌、肺癌、膀胱癌中證明了其有效性。dMMR會導致動態的超突變狀態，從而導致腫瘤細胞新生抗原的持續產生，使其受到免疫監視[36]。然而，腫瘤細胞為了逃避免疫反應，在其細胞表面表達抑制性程序性細胞死亡配體1，其與 T淋巴細胞上的程序性細胞死亡受體1結合并抑制細胞毒活性。研究發現，與pMMR相比，dMMR的CRC具有較高的突變量，并對ICIs治療具有更高的反應效率[37]。如ICIs單藥治療的反應率在dMMR CRC中為30%～50%[38]。美國食品藥品管理局2017年5月23日加速批準pembrolizumab用以治療成人和兒童無法切除或轉移的dMMR實體腫瘤患者，但未能說明免疫治療的最佳治療順序、最佳的治療持續時間，以及在pembrolizumab中是否可以添加其他藥物等問題[39]。因此，可將其看作ICIs探索性治療的突破進展，Wang等[40]提供了1例73歲患有dMMR的轉移性CRC及急性炎癥性脫髓鞘性多發性神經病的女性在長期使用pembrolizumab后癥狀完全緩解的病例，這在一定程度上激勵了免疫治療的探索。更重要的是，ICIs有望與多種其他藥劑聯合應用，包括細胞毒性化學療法、小分子抑制劑、針對促分裂原活化的蛋白激酶途徑的靶向藥劑和放療技術等，但僅對少數具有特異突變表型的CRC患者適用，針對這些藥物的新型標志物仍有待進一步研究[37]。在轉移性高dMMR CRC的一線治療和切除的Ⅲ期結腸癌的輔助治療中，使用ICIs的隨機臨床試驗(分別為NCT02563002和NCT02912559)正在進行中[10]。

4 展 望

目前，MMR相關的CRC仍是臨床研究的重點，并且微生物或生態學領域研究的進展為研究人員提供了新的研究思路和方式。雖然MMR對CRC的診斷、治療和預后具有重要指導意義，但仍有許多問題需要解決，如早期發現dMMR問題相關患者，進行家族特異性的風險評估和管理仍具有挑戰性；MMR相關疾病的一級預防；對于不明原因的dMMR患者，遺傳物質鑒定、遺傳咨詢和篩選需要更準確及合理的治療指南；如何利用MMR獨特的免疫生物學行為，為患者治療個體化的治療方案有待進一步探尋；隨著腫瘤醫療研究的發展，癌癥患者的整體治療、聯合治療及其療效評估亟待大樣本多中心試驗。