牛蒡子苷元對人前列腺癌PC3細胞侵襲、遷移的影響

薛安琪，周冰謙，韓貝貝，韓婷婷，馮金紅

（齊魯工業大學（山東省科學院），山東省分析測試中心，山東 濟南，250014）

牛蒡子苷元（arctigenin，ARG）是由中藥牛蒡子中提取分離得到的木質素類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用。現代藥理學證明，牛蒡子苷元抗腫瘤活性表現為可抑制多種腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞侵襲和轉移等。作用于不同的腫瘤細胞或在不同條件下，牛蒡子苷元的作用機制不同。有研究發現，牛蒡子苷元可通過影響腦膠質瘤相關蛋白（PCNA、GFAP）的表達及抑制 CD40 的表達來調節機體免疫，從而明顯抑制腦膠質瘤生長[1]。另有研究報道，牛蒡子苷元可通過下調細胞中抗凋亡因子Bcl-2基因的表達而促進細胞凋亡[2]。前列腺癌為男性泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，據美國癌癥協會2017年癌癥調查報告顯示，前列腺癌在男性所有腫瘤新發病例中占第1位[3]。在我國，前列腺癌同樣為男性多發腫瘤，其發病率近年呈明顯的上升趨勢[4]，但對其缺乏安全有效的治療措施。以人前列腺癌細胞模型研究牛蒡子苷元的抗腫瘤活性取得了初步進展，Wang等[5]發現，牛蒡子苷元可通過抑制前列腺癌LAPC-4細胞雄激素受體（AR）蛋白的表達而抑制其增殖，李孝慶等[6]發現牛蒡子苷元可誘導PC3細胞發生非凋亡性死亡，推測可能與誘導Bcl-2表達下調相關。牛蒡子苷元影響前列腺癌侵襲、遷移的研究較少，鑒于此，本研究對牛蒡子苷元對人前列腺癌PC3細胞侵襲、遷移的作用進行了觀察，現報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TiSeries 倒置顯微鏡（日 本NIKON公司）；3 111 型細胞培養箱（美國Thermo公司）； D-37520 Osterode型低溫大容量離心機（美國Thermo公司）；EnSpireTM多功能酶標儀（美國PE公司）；BBS-DDC型超凈工作臺（濟南鑫貝西）；LightCycler 480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀（美國Roche公司）。

1.2 材料

人前列腺癌PC3細胞（中國科學院細胞庫）；牛蒡子苷元固體（含量＞98 %，阿拉丁公司）；胎牛血清（購自美國 Gibco 公司）；RNAase 酶（北京索萊寶）；Matrigel基質膠（美國BD公司）；Transwell 24孔板和其他細胞培養板（美國Corning公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF），乙基苯基聚乙二醇 [Nonidet P-40（NP-40）]，Tris，EDTA，結晶紫（美國Sigma-Aldrich公司），其余試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 細胞培養

將PC3細胞接種于RPMI-1640 培養基（添加10 %胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 U/ml），37 ℃、5 % CO2、飽和濕度條件下培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

2.2 MTT法檢測ARG抗腫瘤活性

收集對數生長期的細胞，將細胞稀釋，以5×103個/孔加入96孔板。待細胞貼壁后，加入不同濃度的牛蒡子苷元，使終濃度為100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56 μmol/L。37 ℃培養48 h后，每孔加入0.5 % MTT溶液至0.5 mg/ml，繼續孵育4 h，然后棄去孔內液體，每孔加150 μl DMSO溶解，采用酶標儀于490 nm處測定OD值，利用Origin7.5軟件擬合曲線，計算抑制細胞增殖活性IC50值。

2.3 Transwell法檢測ARG對PC3細胞侵襲的影響

按照12:1的體積比用無血清的RPMI-1640 培養基稀釋Matrigel，鋪于Transwell小室（8.0 μm）的上室，置于培養箱中包被1 h后加入50 μl無血清RPMI-1640培養基水化基底膜30 min。將6孔板中加藥孵育48 h的PC3細胞收集并計數，各小室分別加入1×105個PC3細胞及不同濃度藥物至上室體積為200 μl，實驗組加入2.5，10 μmol/L ARG，陰性對照組加入不含藥物的培養基。下室也加入含相同藥物濃度并含10 %血清的RPMI-1640培養基500 μl。12 h 后，取出小室，膜下表面的細胞用PBS 洗滌一次，晾干后用甲醇固定10 min，晾干，0.1 %結晶紫染色10 min。染色后的小室用PBS 洗3次，然后用棉球擦掉上室內未侵襲的細胞及基質膠，并晾干，顯微鏡下觀察膜下表面的細胞并拍照。然后用33 %醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液采用酶標儀570 nm下測定OD值，計算抑制率。

2.4 劃痕實驗檢測ARG對PC3細胞遷移的影響

將PC3細胞以1×105個/孔鋪于24孔板中，加入培養基培養過夜。用含1 %胎牛血清的RPMI-1640培養基配制2.5 μmol/L和10 μmol/L的ARG溶液待用，用10 μl移液槍槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，PBS清洗掉脫落的細胞，加入ARG溶液培養24 h，2.5，10 μmol/L ARG組及陰性對照分別設3個復孔。吸去培養基，用PBS清洗3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。以劃痕修復率的大小表示藥物抑制細胞遷移能力作用的強弱，修復率越小則抑制遷移能力作用越強，反之則越弱。劃痕修復率=（初始劃痕寬度-終末劃痕寬度）/初始劃痕寬度[7]。

2.5 RT-PCR法檢測基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、MMP-2、CXC趨化因子受體4（CXCR4）的基因表達差異

將PC3細胞以2×105個/孔接種到6 孔板中培養過夜后，加入100 μmol/L、50 μmol/L ARG處理48 h，設無藥物處理的陰性對照。以Trizol法提取細胞總RNA，測其濃度并以總RNA作為模板逆轉錄合成cDNA。將cDNA分別稀釋2倍及5倍，作為模板進行RT-PCR擴增，擴增體系為20 μl：SYBR Green Master 10 μl，cDNA 5 μl，引物 5 μl。利用2-ΔΔCT法進行相對定量分析[8]。基因引物及其序列見表1。

表1 基因引物序列

2.6 Western blot法檢測MMP-9、MMP-2、CXCR4的蛋白表達

細胞以5×105個/孔接種至6 孔板中培養過夜，貼壁后分別加入100 μmol/L、50 μmol/L的ARG溶液處理細胞48 h，設陰性對照組，用胰酶消化、收集細胞。每管細胞加50 μl細胞裂解液，輕輕吹打混勻，冰上裂解30 min。裂解完成細胞液14 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清，得到細胞全蛋白提取液。以Bradford 法測定蛋白質濃度，調整各樣品至相同濃度，加入適量5×loading buffer，95 ℃金屬浴煮10 min，上樣。SDS-PAGE凝膠90 V下電泳0.5 h，140 V下電泳2 h，295 mA轉膜2 h，再經封閉，一抗孵育，二抗孵育并膠片顯色，凝膠成像儀檢測MMP-9、MMP-2、CXCR4及內參GAPDH蛋白條帶并拍照。

2.7 統計分析

用 Excel 軟件處理數據，用 SPSS 13.0軟件進行數據分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ARG對PC3細胞增殖的影響

以MTT法檢測ARG對PC3細胞增殖的影響，結果見圖1。ARG能抑制PC3細胞的增殖，并且具有明顯的濃度和時間依賴性。ARG處理48 h組細胞存活率明顯低于處理24 h組，其差異有統計學意義（P＜0.05）。ARG處理48 h組IC50值為20.1 μmol/L。

圖1 ARG對PC3細胞增殖的影響

3.2 ARG對PC3細胞侵襲的影響

見圖2。由圖2可見，作用12 h后，ARG 10 μmol/L和2.5 μmol/L均能有效抑制PC3細胞侵襲，侵襲細胞數明顯低于空白對照組，且具有濃度依賴性（P＜0.01，P＜0.05）。兩組侵襲抑制率分別為73.5 %、51.3 %。

圖2 PC3細胞侵襲情況

3.3 ARG對PC3細胞遷移的影響

ARG作用24 h后，細胞遷移能力明顯降低，且具有濃度依賴性，結果見圖3。由表2數據可知，ARG 2.5 μmol/L組和10 μmol/L組劃痕修復率顯著降低且明顯低于空白對照組（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 ARG對PC3細胞遷移的抑制作用

表2 ARG對PC3細胞遷移的抑制作用

3.4 RT-PCR 結果分析

以β-actin為內參基因，空白對照組MMP-9、MMP-2、CXCR4基因表達作為100 %表達，由圖4可見，ARG 50 μmol/L組和100 μmol/L組MMP-9、MMP-2、CXCR4基因表達較對照組均有明顯降低，100 μmol/L組基因表達降低更顯著。說明ARG可降低MMP-9、MMP-2、CXCR4的基因表達，且作用具有濃度依賴性。

圖4 MMP-9、MMP-2、CXCR4的基因相對表達量

3.5 Western blot檢測結果

結果見圖5。其中，以GAPDH作為內參，各組中內參GAPDH的含量相當，提示各上樣孔中總蛋白量相同。與空白對照組比較，ARG 50 μmol/L組和100 μmol/L組MMP-9表達水平顯著降低；ARG 100 μmol/L組CXCR4表達水平明顯降低，50 μmol/L組無明顯變化；在兩種濃度ARG作用下，MMP-2表達水平無明顯變化。

圖5 Western blot法檢測MMP-9、MMP-2、CXCR4的表達

4 討論

ARG對多種腫瘤細胞有抗瘤作用，主要有抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞分化、細胞周期阻滯、介導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲及轉移、逆轉腫瘤藥物耐藥性等[9-11]。前列腺癌是常發于中老年男性的惡性腫瘤，早期多無明顯癥狀而難以發現，后期則易發生侵襲和轉移，使其呈浸潤生長，是導致患者最終死亡的重要原因。CXCR4是具有跨膜結構的G蛋白耦聯受體，在直腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤中的表達水平異常升高，并可促進腫瘤生長、轉移、腫瘤血管生成，是腫瘤發生侵襲與轉移的重要標志物[12]。腫瘤細胞的侵襲、轉移過程可分為黏附、降解與轉移3步，首先，腫瘤細胞脫離原發灶后，黏附于基底膜及胞外基質蛋白并激活有關基質蛋白溶解的蛋白水解酶，如MMP家族。酶家族成員中的MMP-9和MMP-2等可降解基底膜及胞外基質，為腫瘤細胞的侵襲、轉移打開通道[10]。因此，可在ARG處理后，通過檢測與細胞侵襲轉移密切相關的MMP-9、MMP-2和CXCR4的基因與蛋白表達變化，并結合對細胞侵襲、轉移能力的影響，確定ARG的抑制侵襲與轉移活性。

本研究在體外利用Matrigel膠和聚碳酸酯膜制成與天然基質膜極為相似的人工膜，以過膜細胞數衡量侵襲能力，觀察到ARG對PC3細胞的侵襲有顯著抑制作用，并具有濃度依賴性。細胞劃痕實驗中，3組初始劃痕寬度相近，作用24 h后差異顯著，ARG 2.5 μmol/L組和10 μmol/L組劃痕修復率顯著降低且明顯低于空白對照組。已有研究報道，ARG作用于肝癌SMMC-7721細胞時，可降低細胞黏附能力，阻止細胞侵襲遷移[10]，本研究結果同樣證實ARG具有抑制PC-3細胞侵襲、遷移的能力。RT-PCR實驗檢測侵襲、遷移相關基因MMP-9、MMP-2和CXCR4的表達，結果顯示，ARG 50 μmol/L組和100 μmol/L組3種基因表達量均低于對照組，厲晶萍等[13]發現，丹參酮聯合大黃素可通過抑制 NF-κB 信號通路抑制HCC細胞中 MMP-9 的表達，從而抑制HCC細胞的侵襲、遷移，推測ARG通過下調MMP-9、MMP-2和CXCR4的基因表達來抑制PC3細胞的侵襲、遷移[14]。Western blot 結果顯示，經ARG作用48 h后，MMP-9、CXCR4的蛋白表達水平明顯降低，MMP-2蛋白水平無明顯變化，推測其基因水平的變化還未反映到蛋白水平表達。

ARG作為一種細胞毒藥物，具有多種生物學活性，可作用于多種腫瘤細胞，對前列腺癌PC3細胞具有顯著作用。本研究結果表明：ARG在體外可抑制PC3細胞的侵襲、遷移，推測與其下調MMP-9、MMP-2和CXCR4的基因與蛋白表達有關。有關ARG抑制腫瘤細胞侵襲、遷移的分子機制還有待于進一步研究。