冠突散囊菌發酵產物的抑菌作用及特性研究

張芳芳，劉 飛，袁 超，高 亮，王 羽，凌沛學,, 朱希強*

（1. 山東大學藥學院，山東 濟南 250012；2. 山東省藥學科學院 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發酵與精制國家地方聯合工程實驗室 博士后科研工作站，山東 濟南 250101；3. 山東省商業集團有限公司，山東 濟南 250014；4. 山東農業工程學院 環境科學與工程學院，山東 濟南 250100）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum），又稱金花菌，是散囊菌目發菌科散囊菌屬的一類真菌。該菌是茯磚茶生產加工過程中的優勢菌，是形成茯磚茶獨特品質的關鍵因素[1]。目前冠突散囊菌發花優劣已作為判斷茯磚茶品質的理化指標，列于國家標準。有研究表明冠突散囊菌有調節血脂血糖[2-4]，改善人體腸道功能[5-7]，抗氧化[8-9]作用。在茯磚茶發花過程中，冠突散囊菌大量生長，其它微生物則受到抑制，提示冠突散囊菌在生長過程中產生了具有抑菌活性的物質。目前已證實冠突散囊菌發酵液有一定抑菌作用[10]，但對冠突散囊菌抑菌產物的性質研究較少。本實驗采用幾種常用有機溶劑提取發酵液中的抑菌活性物質，從而確定發酵液中抑菌物質的極性分布范圍，為天然抗菌素的開發和利用提供參考。

1 材料

1.1 菌種

冠突散囊菌分離自湖南惟楚福瑞達生物科技有限公司所產黑茶[11]。藤黃微球菌（Micrococcus luteus），大腸桿菌 （Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），白色念珠菌（Candida albicans），白色鏈霉菌（Streptomyces albus）均由山東省藥學科學院生物技術中心提供。

1.2 培養基及試劑

冠突散囊菌種子培養基為YEPD培養基（g/L）：葡萄糖20.0，酵母粉10.0，胰蛋白胨20.0，固體培養基含1.5 %瓊脂粉；發酵培養基（g/L）：茶粉6.0，葡萄糖20.0，酵母粉5.0，NaH2PO4·2H2O 1.2，K2HPO4·3H2O 3.0，MgCl2·6H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.01，pH值自然。

藤黃微球菌，大腸桿菌采用LB培養基（g/L）：酵母粉5.0, 胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0；培養白色念珠菌使用YEPD培養基；培養白色鏈霉菌使用YMG培養基（g/L）：酵母粉4.0，麥芽提取物10.0，葡萄糖4.0，固體培養基含1.5 %瓊脂粉。以上培養基均115 ℃，30 min高壓滅菌后備用。無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯與正丁醇為分析純試劑。

1.3 儀器

HPS-20恒溫生化培養箱（哈爾濱東聯）、Multitron通用型震蕩培養箱（伊浮森）、HD-1360潔凈工作臺（北京東聯哈爾）、RE-52旋轉蒸發器（上海亞榮）、SHZ-D循環水式真空泵（鞏義予華）、TW12恒溫水浴鍋（JULABO）、SCIENTZ-1 8 N 冷凍干燥機（寧波新芝）、S O RVA L L RC-6PLUS高速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific）。

2 方法

2.1 供試菌的培養

在相應的固體培養基上劃線培養供試菌，挑取單菌落在液體培養基中振蕩培養，其中藤黃微球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌37 ℃過夜培養；白色念珠菌、白色鏈霉菌于30 ℃培養2～3 d，搖床轉速均為220 r/min。使用無菌水將菌液配制成106～107CFU/ml的菌懸液，4 ℃冰箱保存待用。

2.2 冠突散囊菌發酵產物制備

將甘油保存的冠突散囊菌菌種在YEPD固體培養基上劃線培養3 d，用刮刀刮取固體平板上的孢子于無菌水中混懸（108個/ml），按2 %接種到100 ml發酵培養基中，30 ℃，220 r/min搖床發酵培養5 d。將發酵液上清和菌絲體分離，發酵液上清加入乙醇至濃度為80 %，靜置過夜以除掉蛋白，多糖等雜質，醇沉后上清濃縮至一定體積，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取，各提取3遍后合并提取液，減壓濃縮至浸膏，4 ℃保存待用。

2.3 抑菌活性檢測

在無菌條件下分別吸取100 μl活化后的供試菌菌懸液，加入100 ml熔化冷卻的培養基中，混合均勻后倒入一次性平板，在冰箱中活化2 h后，用無菌打孔器在各平板上打孔。將各待測液用DMSO配制成50 mg/ml的溶液，吸取50 μl無菌濾膜過濾的各樣品溶液置于培養基小孔中。待樣品完全擴散入培養基后，將各平板倒置于恒溫培養箱中培養。藤黃微球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌放置于37 ℃培養箱中過夜，白色鏈霉菌和白色念珠菌放置于30℃恒溫培養箱中48 h，以DMSO為陰性對照，測量各抑菌圈的大小，每組平行測定3次。

2.4 抑菌作用熱穩定性

取適量乙酸乙酯提取物，平均分成4組，分別在40，60，80，100，121 ℃溫度下處理30 min，冷卻至室溫后，以未處理的乙酸乙酯相提取物為對照，以抑菌效果明顯的枯草芽孢桿菌為指示菌，用打孔法測定各處理液的抑菌活性，每個處理重復3次，將平板置于37 ℃過夜培養后測量抑菌圈直徑。

2.5 抑菌作用酸堿穩定性

取適量乙酸乙酯提取物，采用1 mol/L 鹽酸溶液和1 mol/L 氫氧化鈉溶液分別調pH至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，放置2 h，以未處理的樣品為對照，以枯草芽孢桿菌為供試菌，進行抑菌活性檢測，每個處理重復3次，將平板置于37 ℃過夜培養后測量抑菌圈直徑。

3 結果

3.1 抑菌活性

冠突散囊菌不同溶劑提取相對細菌、真菌、放線菌的抑菌作用見表1。

表1 發酵液各提取相對供試菌的抑菌圈直徑

結果表明，發酵液對枯草芽孢桿菌、白色鏈霉菌有較強的抑制作用，對大腸桿菌、白色念珠菌的抑制作用不明顯。發酵液各提取相的抑菌作用顯示，抑菌活性物質主要集中在乙酸乙酯相中，證明抑菌活性物質具有與乙酸乙酯相似的極性。

3.2 抑菌作用熱穩定性

發酵液乙酸乙酯提取物不同溫度處理后的抑菌作用，見圖1。

圖1 溫度對抑菌作用的影響

結果表明，隨著溫度升高（25～121 ℃），抑菌作用略有下降。抑菌圈直徑的浮動范圍為14.10～13.75 mm，可見抑菌物質具有良好的熱穩定性。

3.3 抑菌作用酸堿穩定性

不同pH值下冠突散囊菌發酵液乙酸乙酯提取相的抑菌作用，見圖2。

圖2 酸堿處理對抑菌作用的影響

結果表明，抑菌作用在pH 4～8范圍內浮動較小，在過酸或過堿的條件下抑菌作用變大，通過調整溶劑的pH值檢測抑菌作用，結果表明，與溶劑本身的酸堿度有關，可見抑菌物質有良好的酸堿穩定性。

4 討論

本文研究了冠突散囊菌發酵液不同溶劑提取物對細菌、真菌、放線菌的抑菌作用，發現乙酸乙酯提取相對革蘭陽性菌、放線菌的抑制作用明顯優于其它提取相，表明抑菌物質與乙酸乙酯有相似的極性，乙酸乙酯可有效地濃縮富集冠突散囊菌發酵液中的抑菌活性物質。研究還表明，抑菌物質有良好的熱穩定性和酸堿穩定性，這是分離純化冠突散囊菌發酵液中抑菌活性代謝產物的前提條件，有利于冠突散囊菌功能產品的應用性開發。