R8GD多肽修飾大黃素脂質體的處方優選及含量測定

符 敏，劉晶晶，荊 鳴，蔡馥伊，姚雪敏，程 嵐，李學濤

（遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

大黃素是大黃、望江南、虎杖等多種中藥的主要活性成分之一，具有抑菌、消炎及瀉下等藥理作用[1]。近年，關于大黃素抗腫瘤活性的研究日益增多，可從多種途徑、多個靶點發揮療效，其作用機制主要與抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡等途徑相關[2]。然而，大黃素在體內生理環境pH下溶解度低，很難通過血液運輸被機體腫瘤組織吸收[3-4]。脂質體作為一種新型藥物載體，利用磷脂雙分子層結構對藥物進行包載，可提高難溶性藥物的溶解度，降低藥物毒性，改善藥物在體內的分布，從而提高大黃素的體內生物利用度及腫瘤治療效果[5]。R8GD多肽是一種小分子的細胞穿膜肽，毒性低，且不會產生細胞膜永久性損傷，能有效地將脂質體轉運穿過細胞膜，提高細胞對脂質體中藥物的攝取及藥物對細胞的靶向作用[6]。二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）的PEG親水基團鑲嵌在脂質體表面，使脂質體親水性增強并形成一定的空間位阻，減少血漿蛋白與脂質體膜的相互作用，從而減緩藥物在體內的清除速率，延長大黃素在循環系統的滯留時間[7]。本實驗采用星點設計-效應面法優選R8GD多肽修飾大黃素脂質體的最佳處方，并用HPLC測定R8GD多肽修飾大黃素脂質體中的藥物含量，從而對制劑進行質量控制。

1 材料

1.1 儀器

FA1004型電子天平（上海越平）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫療器械公司醫療器械五廠）；SG3300H型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器公司）；RE52CS型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；JY92-2D型超聲波細胞搗碎機（寧波新芝）；20AT型液相色譜儀（UV檢測器，島津色譜工作站，日本島津）；葡聚糖凝膠（Sephadex）G-50柱（上海華藍）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，上海月旭）。

1.2 藥品與試劑

大黃素（大連美侖，批號：MB5674）；蛋黃卵磷脂（EPC，日本NF公司，批號：120015）；膽固醇（Chol，大連美侖，批號：MB6750）；DSPE-PEG2000（相對分子質量2800.5，日本精化株式會社，批號：B10206）；DSPE-PEG2000-R8GD（遼寧中醫藥大學實驗室合成）。

2 方法與結果

2.1 脂質體的制備

薄膜-超聲分散法制備脂質體。精密稱取處方量的EPC、Chol、DSPE-PEG2000，用氯仿溶解于圓底燒瓶中，40 ℃水浴減壓蒸發除去氯仿，用pH 7.2，濃度0.01 mol/L的PBS水溶液5 ml 將圓底燒瓶底部形成的脂質膜充分水化，然后將水化液轉至10 ml EP管中，置超聲波細胞搗碎機中超聲（超聲5 s，間歇5 s，功率500 W）10 min，過0.22 μm微孔濾膜2次，即得空白脂質體。制備R8GD多肽修飾大黃素脂質體。精密稱取處方量的EPC、Chol、DSPE-PEG2000、大黃素和DSPE-PEG2000-R8GD，用氯仿溶解于圓底燒瓶中，其他操作與空白脂質體制備同。4 ℃密封保存。

2.2 大黃素含量測定方法學研究

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 空白溶液的制備 按2.1項方法制備空白脂質體，精密吸取空白脂質體1 ml于10 ml量瓶中，甲醇定容，超聲破乳，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取1 ml R8GD多肽修飾大黃素脂質體于10 ml量瓶中，甲醇定容，超聲破乳，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取大黃素對照品0.24 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容。另用甲醇配制濃度為5，10，15，20，25，30，35 μg/ml系列對照品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6mm，5 μm，上海月旭）；流動相：甲醇-水（80:20）；進樣量：20 μl；檢測波長：254 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；理論塔板數：以大黃素的色譜峰計算不得低于3000。

2.2.3 標準曲線的建立 分別精密吸取大黃素對照品溶液，按2.2.2項下色譜條件測定，記錄對照品峰面積，然后以對照品的濃度（μg/ml）為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標進行線性回歸。得大黃素的線性回歸方程為Y=128 391X+18 016，（r=0.9996，n=7）。結果表明：大黃素對照品在5～35 μg/ml的濃度范圍內線性關系良好。

2.2.4 重復性實驗 精密吸取R8GD多肽修飾大黃素脂質體1 ml，按2.2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.2.2項色譜條件進樣分析（n=5）。結果大黃素峰面積的RSD為0.94 %，說明該方法的重復性良好。

2.2.5 穩定性實驗 精密吸取同一供試品溶液，按2.2.2項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h進樣分析，測定相應的峰面積。結果大黃素峰面積的RSD為1.03 %；說明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.2.6 加樣回收率實驗 將空白脂質體與等體積的濃度為480.00 μg/ml的大黃素對照品溶液混勻，按2.2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.2.2項色譜條件進樣分析（n=5）。計算得脂質體中大黃素平均加樣回收率為97.20 %，RSD為0.94 %，結果表明該方法符合含量測定方法要求。

2.3 包封率測定

過柱前脂質體：精密吸取 R8GD多肽修飾大黃素脂質體0.5 ml，置入5 ml量瓶中，PBS定容。將該脂質體稀釋液與5 ml甲醇混勻，超聲破乳，然后過0.22 μm微孔濾膜，作為過柱前樣品備用。按2.2.2項色譜條件測定。

過柱后脂質體：稱取2.0 g Sephadex G-50，于PBS中浸泡24 h，使其充分溶脹，濕法裝柱（10 cm×1.5 cm）備用。待凝膠柱上柱面與PBS液面平齊時，精密吸取0.5 ml R8GD多肽修飾大黃素脂質體上柱，PBS緩慢洗脫，用5 ml量瓶收集橙色部分洗脫液，之后用PBS定容，混勻。將該脂質體稀釋液與5 ml甲醇混勻，超聲破乳，過0.22 μm微孔濾膜，按2.2.2項色譜條件測定，每個脂質體重復過柱3次，并按下式計算包封率。

包封率（%）=過柱后脂質體中藥物含量/過柱前脂質體中藥物含量×100 %

2.4 處方優選

根據單因素考察結果，選擇對脂質體中大黃素包封率影響較顯著的3個因素作為考察因素，包括EPC/Chol（質量比，X1）、EPC/大黃素（質量比，X2）、超聲波細胞搗碎機的功率（X3），并確定其用量范圍為：X1：3.0～7.0，X2：10～20，X3：300～700。采用星點設計-響應面法可連續對各個水平進行分析。根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，以大黃素包封率（Y）作為測定指標進行考察。試驗設計及結果見表1、表2。

表1 因素與水平（處方量為5 ml）

表2 星點設計與結果

將表2中數據輸入Design-Expert8.0.6.1軟件，擬合方程為Y=-248.91263+ 79.94188X1說明模型能很好地反映響應值的變化，可用于分析和預測R8GD多肽修飾大黃素脂質體的最優處方。對上述擬合模型進行顯著性檢驗，結果顯示，X1、X2、X1X2、、對Y有顯著影響（P＜0.01）；X3、X1X3、X2X3對Y沒有顯著影響（P＞0.05）。固定一個因素的水平為0，使用Design-Expert8.0.6.1軟件生成各因素對脂質體包封率影響的三維響應面和二維等高線圖，響應面圖見圖1，等高線圖見圖2。由圖1和圖2可見，在磷脂量固定不變的情況下X3對Y的影響不大，但X1和X2對Y有顯著影響。

根據最優處方制備3批R8GD多肽修飾大黃素脂質體，測定包封率。結果顯示，3批樣品的包封率為95.78 %±0.64 %。表明該處方合理，方法可行。

圖1 各因素對脂質體包封率影響的三維響應面圖

圖2 各因素對脂質體包封率影響的二維等高線圖

2.5 含量測定

精密吸取R8GD多肽修飾大黃素脂質體，按2.2.1.2項方法制備供試品溶液，按2.2.2項色譜條件進樣分析，進樣量20 μl，記錄脂質體中大黃素的峰面積及含量。結果見表3。

表3 脂質體中藥物含量

脂質體中大黃素含量為229.872±1.53 μg/ml，RSD值小于1.0 %。綜上，結合實驗室脂質體處方考察經驗及脂質體制備的實際要求和脂質體性狀等因素，確定最優處方為磷脂22 mg、膽固醇4.5 mg、大黃素1.2 mg，處方量為5 ml。

3 討論

體外實驗表明，大黃素對乳腺癌、肝癌、肺癌等多種癌癥都有較好的抑制效果，其作用機制主要與抑制腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡等途徑相關[8]。同時大黃素對抗腫瘤藥物的治療起到協同增效作用，還能增加腫瘤細胞對放療的敏感性并減輕其副作用，因此具有較好的臨床應用潛能。R8GD多肽是一種小分子細胞穿膜肽，可很好地提高脂質體穿過細胞膜的能力，從而發揮更好的腫瘤靶向治療效果。本實驗為改善大黃素的體內水溶性，提高藥物靶向治療效果，制備了R8GD多肽修飾大黃素脂質體。

已有的文獻報道中，大黃素HPLC測定的流動相大多為甲醇:0.1 %磷酸溶液（80:20），考慮到色譜柱對酸的耐受性，本實驗將流動相改為甲醇:水，考察85:15、80:20、75:25等配比流動相的分離效果。結果表明，流動相為甲醇:水（80:20），樣品峰與溶劑峰分離完全且柱效較高，所以本實驗最終確定流動相為甲醇:水（80:20）。

本實驗利用星點設計-響應面法試驗次數少、試驗精密度高及可連續對各水平進行分析等特點，對處方進行優選。確定制備R8GD多肽修飾大黃素脂質體（5 ml）的最優處方為磷脂22 mg、膽固醇4.5 mg、大黃素1.2 mg， R8GD多肽4 mg，DSPEPEG20001.5 mg。2015年版《中國藥典》規定，脂質體包封率應為80 %以上[9]，經驗證該R8GD多肽修飾大黃素脂質體最終處方的平均包封率為95.78 %±0.64 %（n=3），表明該R8GD多肽修飾大黃素脂質體處方符合質量要求。