Hippo信號通路在骨肉瘤中的研究進展

陳敬騰 方 碩 郭衛春

骨肉瘤是最常見的原發惡性骨腫瘤之一，5年生存率僅60%～70%[1]。相比其他肉瘤，骨肉瘤對放射敏感度低，目前其主要的治療方式是手術切除輔以化療，但是伴有肺部轉移的患者5年生存率亦不足20%，亟需尋找新的治療方案[2]。近年來提倡以免疫療法、基因療法及靶向治療與化療結合的綜合性治療方案，而骨肉瘤基因存在著復雜的基因重組及拷貝基因變異，對其進行基因靶向治療仍然是一項艱巨的任務[3,4]。

Hippo是一種進化上高度保守的信號轉導通路，通過控制細胞增殖和凋亡起到調節器官大小和維持組織穩態的作用[5]。現已發現，Hippo信號通路可調控骨肉瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等惡性行為[6]。但關于Hippo信號通路在骨肉瘤中的研究較少，分子調控機制尚不清楚。本文綜述了Hippo信號通路的組成、調節機制及骨肉瘤中Hippo信號通路分子變異情況，以期為骨肉瘤研究和防治提供更廣闊的思路。

一、Hippo信號通路的概述

對Hippo信號通路的描述始于2003年果蠅hippo基因的發現， Pan和Hariharan實驗室研究發現Hippo功能失活負性調控組織生長。隨后，研究揭示Hippo信號通路是一種進化上高度保守的級聯，由接頭蛋白和調控Yorkie(促生長轉錄調節因子)的抑制性激酶組成[7]。哺乳動物中，Hippo信號通路將來自質膜和細胞質的信號傳遞到細胞核中，在核內調節多組不同靶基因的表達，從而控制細胞增殖、分化和凋亡。典型的Hippo信號轉導通路包括哺乳動物STE20樣蛋白激酶1/2 (mammalian STE20-like protein kinase 1/2 ，MST1/2, 為果蠅Hippo同源物)、大腫瘤抑制基因1/2(large tumor suppressor 1/2，Lats1/2)，接頭蛋白Salvador同源物1(Salvador homolog 1 ，SAV1)、Mob激酶活化劑1(Mob kinase activator 1 ，MOB1)、Yes-相關蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP，為Yorkie同源物)和具有PDZ結合基序的轉錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ binding motif ，TAZ，也稱為含WW結構域的轉錄調節因子1，WW domain-containing transcription regulator 1, WWTR1)[7, 8]。Hippo信號通路打開時， MST1/2 激酶發生磷酸化以激活Lats1/2 激酶，活化的Lats1/2在Sav1 的輔助下激活MOB1，繼而Lats1/2的PPxY(PY)基序與YAP/TAZ的WW結構域之間相互作用使YAP/TAZ磷酸化，磷酸化的YAP /TAZ 與14-3-3 結合后滯留在細胞質中，被β-含有E3泛素轉導重復蛋白連接酶(β-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，β-TRCP)依賴性蛋白酶體降解，失去轉錄共激活作用。當Hippo信號通路關閉時，YAP/TAZ轉移至細胞核，與TEA-含有特異性序列轉錄因子(TEA domain-containing sequence-specific transcription factors，TEADs)以及其他轉錄因子形成復合物，激活下游靶基因，促進腫瘤形成[8, 9]。

二、Hippo信號通路的調節機制

筆者對Hippo信號通路的理解大部分來自于在上皮組織中進行的研究， 其中YAP/TAZ的轉錄活性受4個相互關聯的信號調節：①質膜蛋白，它可以直接與YAP/TAZ直接復合，從而在細胞-細胞連接處阻斷質膜信號；②上游接頭蛋白，它可以激活Hippo核心激酶，最終磷酸化YAP/TAZ以抑制其活性；③其他信號通路的交叉串擾調節；④作用于細胞的機械力，它可以局部控制YAP/TAZ定位。

1.質膜蛋白：當細胞密度增加到一定程度時，生長調控信號通過質膜蛋白傳遞到上游Hippo蛋白，進而啟動下游一系列細胞因子表達以調節細胞增殖。目前，研究較多的質膜蛋白有Crumbs極性復合物、G蛋白偶聯受體(G-protein-coupled receptor, GPCR)、CD44以及非典型鈣黏蛋白Fat。Crumbs極性復合物是一種跨膜蛋白，招募位于頂端區域的支架蛋白介導細胞極性，它與其他極性蛋白質和黏附蛋白之間即相互作用，又為Hippo組件提供上游信號輸入因子[10]。GPCR被認為是一種調節Hippo信號轉導通路的質膜蛋白，YAP/TAZ 受到眾多分泌信號和相關GPCR 的調控，從而將Hippo 信號通路與更多胞外信號聯系起來，發揮更多的生理功能[11]。跨膜透明質酸受體CD44在Hippo通路中起到重要作用，它與神經纖維蛋白2(neurofibromin2，NF2，也稱為Merlin)和其他支架蛋白相互作用，募集Lats到細胞膜并在那里磷酸化[12]。非典型鈣黏蛋白Fat能促進FRMD6擴增并定位到頂端連接，導致MST1/2的激活[13]。

2.上游接頭蛋白：Hippo通路的核心元件受上游復雜的調控網絡控制。MST和Lats激酶的活性受多種上游蛋白調節，包括含Ras-相關結構域家族蛋白(Ras-association domain containing family proteins，RASSFs1-10)，腎和腦蛋白(kidney and brain protein，KIBRA)，一千零一個氨基酸蛋白1(thousand and one amino acid protein 1，TAO-1)，MAP/微管親和調節激酶1(microtubule affinity-regulating kinase 1， MARK1)和NF2[14]。RASSFs和SAV1通過與SARAH(SAlvador-RAssf-Hpo)結合域相互作用調節MST活性，之后MST1/2與SAV1形成復合物以磷酸化Lats1/2；MAT1/2-SAV1復合物也可以結合MOB1使MOB1磷酸化，磷酸化的MOB1結合Lats1/2使其發生自我磷酸化[15]。目前已經有越來越多的研究來探討上游蛋白和Hippo激酶之間的相互作用，但它們結合到何種程度還取決于組織類型、細胞環境以及它們對典型Hippo信號通路的依賴性，這仍需要進一步的研究。

Hippo信號通路在細胞接觸抑制、細胞增殖和促進細胞凋亡中起重要作用。隨著細胞匯合增加，腫瘤抑制因子NF2定位在細胞連接處的附近以激活Hippo信號，研究表明抑制YAP可以抑制間皮瘤和腦膜瘤中NF2失活引起癌細胞的過度增殖；另外，敲除肝臟特異性NF2的小鼠中過表達顯示陰性的TEAD能夠抑制腫瘤生長[16]。YAP/TAZ和Lats2之間存在著負反饋回路，YAP/TAZ和TEAD復合后通過NF2誘導Lats2表達，同時Lats2可以通過AMOT磷酸化抑制YAP/TAZ活性。另外，YAP和TAZ之間也可能存在著負性調節，有研究表明，YAP敲除的小鼠中TAZ富集，而體外抑制或過表達YAP會導致TAZ蛋白表達的反向變化[17]。

3.信號通路間的交叉串擾:細胞、器官、組織的狀態和功能由一個多信號通路組成的形態發生信號整合網絡調控，有研究者發現Hippo轉導通路是這個整合網絡的樞紐[9]。雖然肉瘤中通路間交叉串擾仍需要進一步探討，但是已有研究證明這個網絡中許多通路可以單獨引起肉瘤發生。YAP/TAZ已經被公認為是眾多信號級聯的共轉錄激活因子。然而，目前人們對交叉串擾調節方式的認識還處于初步階段，Hippo信號通路與其他通路間是通過協同作用還是拮抗作用來調節生物活動的還需要進一步研究。

Wnt通路與Hippo通路之間存在著相互作用以調節細胞功能。Rosenbluh等在85個癌細胞系(包括骨肉瘤)中進行全基因組規模的功能喪失篩選，發現腫瘤Wnt活化依賴于β-catenin和轉錄因子TBX5。β-catenin來源的原位結腸癌小鼠模型中β-catenin與YAP形成復合物參與腫瘤形成[18]。Heallen等[19]發現敲除小鼠心肌細胞Hippo組件中的Sav1，MST1/2或Lats2后YAP活性增加，且心肌細胞增殖增強。對這些小鼠進行基因譜分析發現Wnt活性增強，而條件性缺失β-catenin一條等位基因后心肌細胞功能受到抑制,證實了Wnt與Hippo通路間的相互作用。TGF-β和Hippo信號通過協同作用指導細胞行為。YAP/TAZ與SMADs相互作用以促進TGF-β和BMP靶基因的轉錄，TGF-β信號轉導可以調節YAP/TAZ表達以驅動間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)分化[20]。Hong等用BMP2處理MSC，發現 TAZ表達增加，其與Runx2的相互作用也增強以促進成骨細胞分化。Notch與Hippo信號轉導間的也存在著協同作用的“交叉串擾”。Notch已被證明是骨和軟組織肉瘤的驅動因素[21]。在YAP/TAZ機械依賴性調節信號轉變為Notch信號轉導調節的過程中，YAP/TAZ將來自細胞外基質的物理刺激轉化為細胞-細胞間信號級聯，繼而控制細胞增殖、凋亡、分化等[22]。綜上，在調節細胞生物學和惡性腫瘤方面，這些見解為研究Hippo信號通路提供了更深入的認識。

4.機械力因素:細胞在發揮維持體內穩態，促進器官發育的功能時，必須及時感知微環境變化且對變化做出相應改變，除了傳輸生物化學信號外，細胞還可以從機械力信號中提取信息。在細胞水平，機械力轉導是通過感知物理刺激(細胞外基質的彈力和細胞-細胞或細胞-基質相互作用產生的力)將其轉化為生物信號，細胞通過快速支架重塑來適應這種物理刺激，將支架重塑與細胞生物行為變化聯系起來的動態因子即YAP和TAZ[23]。因此，機械力刺激可以通過調節YAP/TAZ活性調節細胞命運，并決定干細胞維持、增殖和分化。

在高機械應力和低細胞接觸的情況下，YAP/TAZ轉錄活躍，而致細胞增殖及組織生長；隨著細胞接觸增加，黏附分子激活Lats，導致YAP/TAZ磷酸化而無法進入細胞核發揮轉錄作用[9]。F-肌動蛋白聚合和應力纖維形成均可使YAP/TAZ定位于核內而活化，而破壞F-肌動蛋白則抑制YAP/TAZ轉錄活性。細胞外基質硬度以及細胞形狀可以控制Rho-GTP酶的活性及應力纖維和肌動蛋白束的形成來調節YAP/TAZ定位；而當培養于高硬度細胞外基質或被制成“伸展”形態時，YAP和TAZ在核內活化且MSC分化成成骨細胞[24]。可見YAP和TAZ充當這機械力轉導的感受器和細胞對機械信號響應的介質，YAP/TAZ的這種機械力因素取代了來自細胞-細胞或細胞-基質的接觸因素。

三、骨肉瘤Hippo信號通路變異

1.YAP:人類組織芯片分析證實骨肉瘤中YAP1表達量高于周圍非腫瘤組織，并且表達量與腫瘤級別相關，78%的人類骨肉瘤樣本中YAP1高表達，同時靶基因表達量也增多[25]。體外實驗中，抑制YAP表達后細胞增殖及細胞侵襲能力降低，Runx3、CyclinD1和MMP-9的表達量也降低；動物實驗中，抑制小鼠異種移植骨肉瘤或轉基因小鼠成瘤模型的YAP活性后腫瘤生長被抑制[26]。

骨肉瘤中YAP上調的機制復雜，其中干細胞轉錄因子Sox2起著重要作用。在小鼠骨肉瘤細胞系中，Sox2直接抑制Hippo通路激活劑NF2和Kibra,導致YAP高表達，細胞繼續培養成為干細胞富集的骨肉瘤球后，YAP表達量則更高(而NF2表達量更低)。在敲除Sox2基因的細胞中，無論是Yap過度表達還是NF2抑制都能促使骨肉瘤球形成；而抑制YAP或者高表達NF2卻促進成骨分化并抑制骨肉瘤球形成。過表達野生型YAP或活化重組突變型YAP能夠抑制NF2誘導的骨肉瘤細胞分化表型，而缺乏TEAD結合位點的突變型YAP沒有此作用。Sox2通過經典Hippo信號轉導途徑調節YAP活性，抑制MST1/2或Lats1/2消除了NF2誘導的成骨分化作用，YAP的表達和功能也發生變化[27]。

YAP上調也可受Hedgehog通路調節。Ptch1c/+、p53+/-、HOC-Cre突變小鼠中惡性骨肉瘤具有高外顯率，在p53雜合背景下Hedgehog信號部分上調，并且所得腫瘤中YAP1高表達，而在抑制Hedgehog信號后YAP1表達又顯著降低，YAP1所引起的腫瘤進展也被抑制。Chan等[28]也表明Hh-YAP軸可能通過調節LncRNA-H19的表達導致腫瘤發生。

2.RASSFs：現已證明RASSF5與RASSF10是骨肉瘤的腫瘤抑制因子，類似于RASSF家族中其他成員，在人類腫瘤(包括骨肉瘤)CpG島啟動子超甲基化作用下RASSF5和RASSF10下調。在一份載有45例骨肉瘤樣本的組織芯片數據中，RASSF5顯著下調，其表達量與腫瘤遠處轉移呈負相關。體外實驗中，抑制U2OS細胞RASSF5表達，則MST1促凋亡功能失活，從而抵抗TNF-α誘導的細胞凋亡；相反地，高表達骨肉瘤細胞系中的RASSF5，細胞的增殖能力和侵襲能力減弱，而細胞凋亡增強[29]。

3.NF2：人類生殖細胞或體細胞中NF2的一個等位基因突變將會導致2型神經纖維瘤病發生，該突變與神經鞘瘤，腦膜瘤和室管膜瘤也有相關性。NF2雜合的小鼠具有高致瘤率，能導致多種惡性腫瘤發生，其中骨肉瘤發生率為63%。而在這些腫瘤體細胞內野生型NF2等位基因均存在突變，也就意味著NF2雜合性的喪失可能導致肉瘤生成。

4.CD44：CD44是一種細胞表面糖蛋白，可將細胞外信號傳遞給ERK，AKT和Hippo通路。研究發現，異種移植小鼠中降低CD44表達可以觀察到骨肉瘤惡性表型增強，但在體外實驗中，發現CD44被NF2抑制后會導致骨肉瘤細胞系遷移和侵襲能力減弱。Hartmann等表明NF2與CD44復合后通過ECM信號介導接觸生長抑制。

5.MOB1：在體外實驗中，MOB1A高表達會降低細胞增殖能力，而抑制MOB1A表達將導致異常有絲分裂。在缺失MOB1A和MOB1B的雙突變小鼠中，兩個等位基因完全喪失(MOB1AΔ/Δ1Btr/tr，MOB1A無效突變，MOB1B基因陷阱)會導致胚胎死亡。然而，保留任一個等位基因(MOB1AΔ/ +1Btr /tr或MOB1AΔ/Δ1Btr/ +)的雙突變小鼠可在70周內存活，并且100%能自發形成腫瘤。24%的小鼠(9/37)出現骨外骨肉瘤，而92%小鼠(34/37)出現良性外生骨疣。檢測單個雜合子(MOB1AΔ/ +1Btr /tr或MOB1AΔ/Δ1Btr/ +)組中，發現所有腫瘤都顯示野生型MOB1等位基因缺失，表明雜合性缺失可能是腫瘤生長所必需的。

四、展 望

Hippo信號通路是一種進化上保守的腫瘤抑制網絡，不僅對正常的細胞、組織和器官的發育，體內平衡和修復有重要作用，在許多癌癥中也發現它調控異常。目前，上游核心Hippo通路成員、接頭蛋白的遺傳和表觀遺傳失調已經被注意到，Hippo信號在正常和癌性間充質細胞行為和命運的機械轉導中的作用提供了對肉瘤生物學的更多見解。Hippo通路中單個基因的突變會造成通路調節的失調進而促進腫瘤的發生，但其在骨肉瘤中發生、發展機制尚不清楚，需要進一步的研究來闡明特定肉瘤亞型中Hippo途徑失調的潛在機制，為成功開發治療干預骨肉瘤提供基礎。