腫瘤c-Met靶向分子成像探針的研發、制備與應用進展

燕 吉 韓兆國 孫夕林

近年來，腫瘤的發生率和病死率逐年上升，而目前常規檢查方法包括血清學、病理學、常規影像學等，均存在很多缺點，如血清學檢查的特異性不足，診斷不明確；病理活檢多只適用于位置表淺的病灶；常規影像學多在病灶出現明顯形態學變化時方有一定價值，無法進行早期診斷。

分子成像運用影像學手段體現活體狀態下分子水平變化，支持定性定量研究，其特異性強，可以對腫瘤分子類型進行準確判別；分子成像探針可直達病灶，在出現形態學變化之前，實現對腫瘤的早期診斷。迄今為止，美國食品和藥物管理局已批準一系列低分子抑制劑，用于各類受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)的靶向診療，而c-Met作為一類重要的RTK，在調節腫瘤細胞的生物學特性方面扮演重要角色，針對c-Met的靶向治療受到越來越多的關注[1]。目前的研究熱點在于開發可以無創在體定量檢測c-Met水平的成像方案，而其關鍵又在新型c-Met分子探針的開發。本文主要目的是綜述報道的c-Met分子成像研究在探針設計、構建及應用等方面的特點及研究進展。

一、c-Met通路

1.c-Met正常通路：c-Met是原癌基因c-Met的編碼產物，有酪氨酸激酶活性，其內源性配體為肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)。據報道，腫瘤的發展和轉移與HGF及c-Met表達的增加高度相關。c-Met基因由Cooper等[2]研究發現，位于染色體7q21～q31。c-Met與HGF結合后，其在酪氨酸1234和1235處發生同型二聚化和磷酸化，隨后在1349和1356處發生[3,4]。磷酸化后，這些酪氨酸招募GRB2、PI3K、PLCγ等一系列信號分子，進而調節細胞增殖、運動性、細胞周期[3,5]。

2.c-Met異常通路與腫瘤發生：c-Met通路在人體處于正常狀態時，可受到精準調控而保持穩定。然而，調控出現異常時往往伴隨著腫瘤的發生以及信號通路高度活化。腫瘤中的c-Met通路的異常激活，相關機制包括配體依賴性自分泌、旁分泌機制及配體非依賴性機制[6]。c-Met的異常激活引起細胞的增殖、侵襲，細胞凋亡的抑制以及血管生成[7]。在包括胃癌、乳腺癌、肺癌等諸多癌癥中，c-Met的突變、擴增或過表達經常發生，并且c-Met的過表達還與腫瘤轉移高度相關[8,9]。

二、c-Met檢測方法

c-Met的傳統檢測方法有直接測序法、實時熒光定量(quantitative real-time PCR,RTFQ-PCR)、熒光原位雜交法(fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)[10]。直接測序法主要檢測c-Met突變，然而部分腫瘤患者如非小細胞肺癌患者c-Met突變的發生率較低，因此其對于篩查c-Met靶向治療獲益人群的指導意義有限；RTFQ-PCR和FISH主要檢測c-Met擴增，但存在陽性率低等問題；IHC主要檢測c-Met過表達，敏感度高，但特異性差[11]。c-Met靶向分子成像可以無創、精確地檢測到腫瘤位置、靶點活化程度等異質性信息，它高效、無害且可重復性強，而c-Met靶向分子探針的研發又是c-Met分子成像研究開展的關鍵和基礎，其較傳統檢測方法有以下明顯優勢：①探針前體可直接放射性標記，具有清晰的結構，可精確確定藥代動力學信息及安全性信息等;②可提供更準確的定量信息; ③探針易于修飾，適應成像需求[12]。

三、c-Met分子成像探針

c-Met靶向分子探針的結構設計、定點修飾等是制備穩定、安全、高效探針的先決條件，探針的基本結構由靶向基團、連接部分和示蹤部分組成，通過連接物經特定方法將靶向基團與放射性同位素、順磁性物質或光聲造影劑進行連接，靶向基團是探針最重要的結構，包括特異性的抗體、蛋白、多肽及高親和力低分子化合物等。下文將依據靶向基團分類分別闡述不同類別c-Met分子探針的構建、優化及應用情況。

1.蛋白及抗體類：以HGF和各種不同抗c-Met單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)作為靶向基團構建c-Met探針，是目前應用于靶向c-Met分子成像研究最廣泛的一類探針，其結合原理為抗原-抗體結合、受體-配體結合或者酶-底物結合等。鑒于抗c-Met抗體具有高特異性、高親和力、修飾承受度大等優勢，此類探針在c-Met分子成像研究中得到廣泛應用。Perk等[13]以DN-30作為靶向基團，進行89Zr標記后用于c-Met靶向成像研究，DN-30是一種來源于鼠免疫球蛋白G2a的抗c-Met單克隆抗體。探針合成方法簡述如下：將去鐵胺琥珀酰化，再與DN30的賴氨酸殘基偶聯后，將pH值調至7.0，用89Zr標記。在PD10柱上純化后得到終產物89Zr-N-sucDf-DN30。 連接介質先與抗體偶聯, 然后在偶聯物上標記放射性核素，采用這種方法的優點是放射性利用率較高。該制備方法不需特殊條件，原料易得。但步驟較多，相對耗時，且標記產率較低。在靶向性驗證過程中，c-Met陽性實驗組攝取探針明顯高于陰性組，但在肝臟和脾臟有大量攝取，背景信號太高，致使圖像整體對比度稍低。Jagoda等[14]使用了改進后的合成方法，不同的是換用了c-Met靶向治療性單臂單克隆抗體奧那妥珠單抗(onartuzumab)，它是具有納摩爾級別親和力的c-Met選擇性人源化單臂單克隆抗體，在小鼠腫瘤模型中證實對腫瘤生長有抑制作用且具備臨床轉化潛力[15]。探針89Zr-Df-onartuzumab的標記產率>90%。

相比于DN30(部分激動劑)，onartuzumab親和力和靶向特異性更強，生物抑制效應更為完整。體外和體內多項實驗驗證了其良好的靶向性、安全性和穩定性。Li等[16]提出，無論是DN30還是onartuzumab，都具有完整的可結晶段(fragment crystalline,Fc)，需3～7天方能從體內循環中清除。為克服這一缺點，該研究者對單克隆抗體的結構加以修飾,選用單鏈可變片段，將其中的H2片段重組，在保證探針靶向性的基礎上明顯降低了探針的分子量。在連接介質方面，區別于傳統的去鐵草酰胺(desferrioxamine,DFO)，Li等將DFO同馬來酰亞胺相鰲合，形成新的連接介質馬來酰亞胺化去鐵草酰胺(maleimide-DFO)，這種改進使核素-連接介質-抗體聯結體更加穩定，不易分解。該合成標記產率為49%，放射化學純度為95%。該新型探針與傳統探針比較腫瘤攝取水平略低，但所得到圖像的對比度得到很大提高，得益于探針分子量的降低以加快了其在體內的循環代謝。另外，前文描述的基于DN-30和onartuzumab的探針，結合抗體均為單價片段，該研究者證實單價片段不能抑制c-Met陽性細胞生長，說明需二價結合，該基于二價抗體片段的探針可將c-Met鎖定為禁止下游信號轉導的構象以實現高效結合。

HGF是c-Met的唯一的內源性配體，依據受體-配體結合原理將其改造為靶向探針，可特異性結合c-Met靶點。曾有研究者直接將HGF作為分子顯像劑，研究病變的血流動力學改變，實現了c-Met活化狀態的檢測，但未修飾的HGF將難以避免相關的生物學效應及其潛在危害。Luo等[17]將HGF加以修飾，使其用于放射性核素標記的成像研究。該研究者選用重組人HGF(recombinant human hepatocyte growth factor,rh-HGF)，將其與連接介質p-SCNBn-NOTA綴合，pH值調至9.0，常溫下反應1h。放射性標記過程比較簡單，只需將64CuCl2溶在乙酸鈉緩沖液(pH值為6.5)中，加入到前體物質中，常溫即可標記。再經PD10柱純化后制得。該探針的合成方法簡單，條件溫和，前體具有一定的臨床藥用基礎，更易于轉化。合成過程中使用了NOTA，一種大環類雙功能聯接劑，以其作為連接介質可以提高探針穩定性，這是由于配體的剛性架構束縛了綴合位點與放射性核素。rh-HGF分子量顯著小于傳統單克隆抗體，因此，該探針的消除速率比傳統單克隆抗體類探針更高。脂蛋白是一類低分子量蛋白質，其天然特性使其具備優良的生物相容性，是作為靶向分子探針的理想材料。

Anticalin是一種基于人脂蛋白支架的新型生物治療藥物，能夠與抗原特異性結合，分子量比單克隆抗體小約8倍。von Scheltinga等[18]設計出一種靶向c-Met的anticalin，稱為PRS-110，采用89Zr標記，標記方法簡述如下：將89Zr-草酸鹽溶液用Na2CO3調節至pH值為4.0～4.5，兩者在室溫反應3min，用過量的羥乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid,HEPES，pH值為7.2)使溶液的pH值達到6.8～7.2，加入PRS-110并溫育60min，得到終產物89Zr-PRS-110。該探針HPLC分析結果表明，前體與放射性核素結合緊密，探針穩定性較強。脂蛋白類探針是今后靶向c-Met靶向成像探針研發的一個新的潛在熱點。但此類探針的脂溶性較高，聚集于肝膽系統，對圖像對比度造成一定影響。

近年來，蛋白及抗體類c-Met分子探針的開發已取得較大進步，但也存在以下問題：①體內清除緩慢，這與探針靶向基團的分子量過大有關，在保證靶向性能的前提下盡量降低靶向基團的分子量將是未來發展的關鍵;②難以避免的免疫原性及相關生物學效應將帶來潛在的安全問題;③背景噪聲高，這與探針常積聚于肝膽系統有關。對探針進行修飾，調整其水溶性，可在一定程度上克服此類問題。

2.多肽類：多肽是氨基酸以肽鍵形式連接在一起形成的生物高分子，c-Met特異性多肽以劑量依賴的方式與HGF 競爭結合，具有改造為高效c-Met分子探針的潛力。多肽分子量較小，靶點結合效率較高，且易于結構修飾，具有低毒、低免疫原性等優點。然而，有些以多肽結構為基礎的分子探針在實際合成和應用過程中涉及到特殊試劑的使用，在一定程度上降低了探針安全性，限制了其臨床轉化。基于以上方面，下文將分類探究多肽類c-Met探針的性能特點及在合成應用過程中面臨的挑戰。從多肽庫中使用細胞因子受體篩選出的細胞因子模擬肽，具有活性強、分子量小等優點，主要包括直鏈肽類和環肽類。Kim 等[19]從噬菌體多肽庫中篩選出c-Met抗原表位模擬肽NH2-Lys1-Ser2-Leu3-Ser4-Arg5-His6-Asp7-His8-Ile9-His10-His11-His12-Ac，將其命名為cMBP,即c-Met binding peptide。并證實該多肽可與c-Met特異性結合，通過一定的結構改造將其與甘氨酸(G)或氨基辛酸(AOC)連接，用于125I標記(125I-cMBP-G和125I-cMBP-AOC)的c-Met分子成像研究。前體制備及探針合成方法如下：在堿性條件下除去芴甲氧羰基(fluorene methoxycarbonyl,Fmoc)保護基團后，多肽被分離出來，隨后連接G和AOC，生產出前體cMBP-GGG和cMBP-AOC，采用氯胺T碘標法，加入氯胺T和Na125I后加入亞硫酸鈉終止反應。放射化學純度為90%～95%。親和力測定實驗證實，經G或AOC修飾后的多肽探針與c-Met之間的親和力較修飾前明顯提高。125I-cMBP-GGG在腫瘤攝取方面優于125I-cMBP-AOC，這說明連接部分含有3個甘氨酸可以提高探針的親和力，其原理是提高了探針的脂溶性及滯留能力。該研究者又將基于cMBP的探針研究拓展至光學成像領域，將cMBP-GGG和cMBP-AOC分別同花菁染料5.5 (cyanine dyes5.5,Cy5.5)共軛連接，制備出靶向c-Met光學成像探針[20]。Cy5.5是一種近紅外光染料，已廣泛應用于光學分子成像研究，僅需亞納摩爾級別便足以滿足實驗需求。該光學探針的合成方法簡述如下：Cy5.5馬來酰胺化后，與cMBP-GGG或cMBP-AOC混合，暗室室溫孵育6h。該探針可通過實時光學成像顯示c-Met的表達量。

Li等[21]使用18F標記，基于多肽Met-pep1(YLFSVHWPPLKA)，合成新型分子探針18F-FP-Met-pep1。該研究者創新性地使用18F的丙酸鹽與多肽相連接，保證了多肽與放射性核素連接的穩定性。經二異丙基乙胺(diisopropylethylamine，DIPEA)及二氯甲烷(CH2Cl2)等物質處理后，由乙醇洗脫制得。放射標記率在55%以上，純度為97%。探針在腫瘤攝取能力強，可通過尿路迅速排出。雖然以上探針都取得了符合預期的結果，但直鏈肽類探針存在以下缺點：直鏈肽在生物體內酶的作用下易被降解，影響探針的穩定性；另外，直鏈肽的構象柔性符合受體的構象要求方面稍有不足，導致其受體選擇性方面不如環狀多肽。相對于直鏈肽，環肽具有較強的生物活性，其環狀結構決定其穩定性及抗酶解能力均強于直鏈肽，生物利用度也遠高于直鏈肽。

Burggraaf等[22]將一種商品化的c-Met特異性環肽AH-111972與連接肽GGGK連接后，以Cy5衍生熒光染料(Cy5.7)修飾，構建了一種新型光學c-Met靶向探針GE-137，并將此探針用于熒光內窺鏡成像，與病理切片比較，結果一致性良好，實現了臨床轉化。體外遺傳毒性和光毒性研究結果證實，該探針安全性較高。Arulappu等[23]選用GE-137的靶向多肽結構，將其進行18F標記，制備了新型c-Met靶向分子探針。標記采用兩步法，第一步：從經輻照的靶水中回收18F的氟化物，然后洗脫到環烯烴共聚物反應容器中，在120℃14N2氣流下干燥。 隨后與甲磺酸鹽反應產生18F-氟苯甲醛。第二步：將肽前體溶解于苯胺鹽酸鹽的水溶液中并加入到18F-氟苯甲醛中，通過18F親核取代反應實現放射性標記，得到粗產品，經C18固相萃取柱純化后制得終產品18F-AH113804。總合成時間為49min，放射化學純度>90%。此探針親和力高，且藥代動力學特性良好。成像對比度高、背景噪聲低。靶向c-Met多肽類探針在安全性、可修飾性、合成工藝優化等方面均優于蛋白及抗體類，這與其生物相容性高、篩選方式及修飾優化等因素有關。

3.低分子類：目前關于c-Met靶向分子成像的低分子類探針研究較少，且主要來源于低分子類c-Met酪氨酸激酶抑制劑。此類物質常具有較高的水溶性，多經腎臟排泄。因其分子量小、結合力強、消除速率高以及毒性小等優勢而被廣泛應用于探針研發。靶向c-Met低分子抑制劑SU11274，可在c-Met胞內部分的ATP特定位點結合， Wiest等[24]通過實驗證實其可在胞內迅速聚集，阻斷c-Met磷酸化。Wu等[25]將其進行結構優化，構建了11C標記的c-Met靶向探針。由于使用11C標記，而11C的半衰期較短(t1/2=20min)，不適合進行多步復雜的標記，該研究者遂采用直接甲基化法，并未增加連接介質，這點區別于其他c-Met靶向分子探針的構建。雖無連接介質，探針并未出現脫標情況，說明此法可行。該探針標記產率為90%～95%，放射化學純度>98%。成像結果顯示，探針在腹部的攝取明顯低于抗體及多肽類探針。

低分子抑制劑JNJ38877605、ARQ-197等均在實驗中證實有抗腫瘤增殖的作用[26，27]，它們的結構具備修飾潛力，可嘗試連接放射性核素，進行PET成像研究。研發低分子類探針在制備流程中應注意以下問題：在提高水溶性的過程中不能過多降低脂溶性，否則將影響跨膜遞送；人工合成后的低分子物質不可忽視安全性評估；修飾時不可破壞原結構等。

四、展 望

c-Met靶向分子成像研究對腫瘤c-Met異常表達水平的精準定量意義重大，而探針的研發是成像研究的關鍵點和重點，直接影響著該領域的研究進展。近年來，c-Met分子探針在合成方法上不斷創新，篩選途徑和修飾手段持續多樣化，合成步驟不斷簡約化。通過“先標記再偶聯”的方法，可以提高探針的放射性利用率；通過選用生物相容性強的片段，可以提高探針穩定性。通過在尾端修飾3個甘氨酸，可以提高探針親和力。并且在保證不脫標的情況下盡量縮短時間，從而降低半衰期過短的不良影響。目前，合成方法研究較成熟的是靶向c-Met 抗體類探針，高效的靶向性保證了探針的穩定性和準確性。而低分子探針在藥代動力學、診療一體化及臨床轉換等方面均優于蛋白、抗體及多肽類，因此它將是c-Met靶向成像研究的重點和方向，但其合成方法復雜，需在合成和優化結構方面深入研究。相信蛋白組學和基因組學的不斷進展，以及c-Met靶向探針制備方法的不斷改進，將極大促進c-Met分子探針開發和c-Met分子成像研究及其在臨床轉化及應用方面的進展。