不同亞型抗心磷脂抗體和抗β2糖蛋白1抗體與體外受精結局的關系

許詠樂，王家雄，韓慕天，楊慎敏，王瑋，李紅

(南京醫科大學附屬蘇州醫院，蘇州市立醫院生殖與遺傳中心，蘇州 215002)

隨著輔助生殖技術(ART)的發展，女性患者的妊娠率得到了極大提高，但分娩率卻僅有20%左右，其重要原因之一是較高的流產率[1]。流產，尤其是反復流產困擾著眾多適孕年齡的女性，然而流產病因十分復雜，超過50%的病例病因不明[2]。已知病因可分為非免疫類，如胚胎染色體或流產夫婦染色體異常、生殖道解剖異常、內分泌異常和感染等病因，而另一類，就是如今逐漸被大家重視的免疫因素引起的流產[3]。免疫因素流產還可以再被細分為自身免疫因素和同種異體免疫因素，自身免疫因素中最常見的就是抗磷脂綜合征(antiphosphoplipid syndrome，APS)，實驗室常用的檢測指標有：抗心磷脂抗體(anticardiolipin antibody，ACA)、抗β2糖蛋白1抗體(anti-β2 glycoprotein 1 antibody，anti-β2GP-1)、狼瘡抗凝因子(lupus anticoagulant，LAC)[4]。雖然臨床檢測按免疫分型將ACA與anti-β2GP-1檢測細分為IgA、IgM和IgG三種分型，但具體分型與流產的相關性研究很少報道，ACA與anti-β2GP-1具體分型與體外受精(IVF)結局的研究也鮮有報道。本研究通過統計患者623個周期的ACA與anti-β2GP-1不同分型與臨床輔助生殖參數，探討這兩種抗體與流產以及IVF結局的關系。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年6月至2017年12月在我院本部生殖與遺傳中心就診、因“不明原因不孕”行IVF治療的563對夫婦(共623個周期)的臨床資料。

二、研究方法

1. 常規IVF程序：促排卵采用本中心常規促排卵方案，凍融胚胎移植采用自然周期或人工周期準備內膜，選擇1～2個體外受精后第3或5天胚胎進行移植，移植后常規黃體支持，移植日后12 d測外周血β-HCG，如β-HCG 陽性者移植后35 d左右行陰道B超檢測確定臨床妊娠。

2. 分組：根據周期類型，將樣本分為鮮胚移植周期組和凍融胚胎移植周期組，各組再根據所做的項目不同，分為 ACA IgA組、ACA IgM組、ACA IgG組與anti-β2GP-1 IgA組、anti-β2GP-1 IgM組、anti-β2GP-1 IgG組，觀察各項指標與抗體數值的相關性。各組內按其妊娠結局再分為妊娠失敗組、流產組與活產組，比較抗體數值組內差異。

3. 觀察指標：比較各組間年齡、不孕年限、體重指數(BMI)、基礎內分泌等一般情況；對于鮮胚移植周期，觀察優質胚胎率、臨床妊娠率、流產率、活產率等臨床指標；對于凍融胚胎移植周期，著重觀察流產率、活產率等指標。

4. ACA與Anti-β2GP-1測定：對入組的行IVF的患者在治療前抽外周血檢測ACA與Anti-β2GP-1，避免IVF治療過程對抗體數值的影響，ACA與Anti-β2GP-1測定均采用QUANTA Flash?試劑盒(Inova Diagnostics，美國)，利用BIO-FLASH 儀器(Inova Diagnostics，美國)，采用化學發光免疫分析法對女方血清中的兩種抗體進行檢測，檢測前利用標準品進行定標。

三、統計學分析

結 果

一、一般資料比較

各組間年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH、基礎LH 、基礎E2、基礎T及基礎PRL均無顯著性差異(P>0.05)。

二、入選患者不同周期及不同結局分組抗體檢測數值比較

凍融胚胎移植周期患者的ACA IgM、IgG組及anti-β2GP-1 IgG組中，流產患者的抗體檢測數值均顯著高于其余兩組患者(P<0.05)；雖然鮮胚移植周期患者納入統計的周期數較少，但ACA IgG組和anti-β2GP-1 IgG組中的抗體檢測數值均顯著高于其余兩組(P<0.05)(表1、2)。

三、鮮胚移植周期患者輔助生殖參數與抗體檢測數值相關性分析

將抗體分型檢測數值與各項輔助生殖參數進行相關性分析發現，ACA IgA與輔助生殖治療過程中的Gn持續天數呈負相關(P<0.05)，而ACA IgG與獲卵數呈顯著負相關(P<0.05)，抗體數值與其他參數均無顯著相關性(P>0.05)(表3)。

四、多因素Logistic回歸分析

以妊娠失敗為因變量，以女方年齡、男方年齡、不孕年限、平均獲卵數、女方BMI、ACA以及anti-β2GP-1為自變量做多因素Logistic回歸分析，結果顯示女方年齡、男方年齡、不孕年限、獲卵數、女方BMI與流產的發生均無統計學關聯；而ACA IgM、IgG以及anti-β2GP-1 IgG的升高對流產的發生有統計學關聯(P<0.05)，即這三個指標高時觀察到流產的概率較高(表4)。

表1 凍融胚胎移植周期患者的抗體分型檢測數值比較(-±s)

注：與同類抗體其他組比較，*P<0.05

表2 鮮胚移植周期患者的抗體分型檢測數值比較(-±s)

注：與同類抗體其他組比較，*P<0.05

表3 鮮胚移植周期患者的生殖參數與抗體檢測數值相關性分析(-±s)

注：與其他組比較，*P<0.05

表4 多因素Logistic回歸分析各因素對流產的影響

注：*P<0.05

討 論

抗磷脂抗體(anti-phospholipid antibodies，aPL)是一組能與多種含有磷脂結構的抗原物質發生反應的自身抗體，其中臨床檢測常用的為ACA和anti-β2GP-1。aPL與不孕癥的關聯假定在80年代首次被提出，時至今日，在沒有明顯的關聯或有效治療的情況下，該假定仍然存在很大的爭議[5]。最近一篇文獻評估了31項研究，統計了女性不孕與aPL的陽性關聯，其中45%的研究證實了ACA陽性與不孕之間的關聯，當排除了LA測試結果的影響時，這一比率降低至31%，而只有4項研究評估了抗β2GP1抗體，3項報告其與不孕癥呈相關[6]。我們此次的研究針對行IVF治療的不孕女性，對ACA與Anti-β2GP-1的具體分型與IVF結局進行了統計分析，發現凍融胚胎移植周期ACA IgM、IgG組，anti-β2GP-1 IgG組中，流產患者的抗體檢測數值均顯著高于其余兩組患者，而鮮胚移植周期ACA IgG組、anti-β2GP-1 IgG組中的抗體檢測數值均顯著升高。這一結果得到了國外研究的文獻支持，Qublan等[7]發現，相較于其他血栓形成因子，ACA和LA抗體在重復IVF失敗的女性中更常見。

雖然通過一系列的動物模型試驗，流產胎盤免疫檢測以及臨床隊列等研究已逐漸證實aPL可導致流產，但目前研究者們尚未確定aPL可能誘發流產以及不孕的精確病因機制[8]。對于不孕，一些專家假設aPL可能在分泌到卵泡液后破壞卵母細胞的發育，另一種理論設想aPL可能會干擾子宮蛻膜化，導致植入障礙并最終導致不孕[5]。但我們此次的研究未發現種植率與兩個免疫指標的相關性。而對于aPL引發流產的機制，目前已有研究觀察到aPL在體外與子宮內膜內皮細胞結合，損害血管生成[9]。同時體內模型也獲得了aPL破壞蛻膜組織的證據，aPL IgG處理后的小鼠顯示出蛻膜壞死，同時伴有明顯的血管內蛻膜IgG和纖維蛋白的沉積[10]。另外還有一些報告認為血栓性紊亂在部分流產患者的病程中也起了重要作用[11]。體外實驗證明，anti-β2GP-1能抑制內源性的凝集通路及抑制血小板上的凝血酶原酶的活性，從而引起血栓，繼而引發流產[12]。

雖然此次研究沒有進一步發現ACA與anti-β2GP-1與其他輔助生殖參數的關系，但是有趣的是，我們發現ACA IgG的數值與獲卵數呈負相關。迄今為止，關于APS女性生育率的研究中只有兩項評估了aPL陽性和APS的女性卵巢儲備的關系[5]。2014年，一項橫斷面研究評估了18例APS女性和24例健康對照者的卵巢儲備，發現APS患者顯示出與對照受試者相似的AMH，FSH，LH和E2水平，但診斷為APS的女性，其竇卵泡超聲計數較低[13]，這與我們的數據相符。另一項研究則是發現ACA、anti-β2GP-1、LA與aPS的三種免疫分型與AMH存在顯著關聯，而AMH是卵巢儲備的重要標志，從而間接推測aPL對卵巢儲備的影響。雖然此次我們還發現了ACA IgA對Gn持續天數的影響，但是這并未得到過往文獻的支持，其意義仍有待后續實驗驗證。

anti-β2GP-1是臨床檢測免疫因素引發的流產的重要指標，檢測其不同免疫分型可以避免漏篩隱匿性的自身免疫因素。此次研究發現對于流產的預示作用，IgG分型似乎最好，IgM也有其重要作用，而IgA作為補充，預示作用不及另兩個免疫型，這從三種抗體免疫亞型的特征上也很好解釋。據文獻報道，反復流產患者和不孕癥患者的ACA 多以IgG 和IgM 形式存在，IgM型ACA 患者易患血栓癥顯著高于IgG 型ACA 患者，若同時檢出ACA IgA，一般預示病情較重[14]。

目前雖然APS在復發性流產病例中所占比例僅為2%～15%左右[4]，但因其病因難以診斷，治療難以開展，導致后果十分嚴重，必須引起臨床的高度重視。針對自身免疫引起的流產，臨床采用免疫抑制療法[3]和抗凝療法[15]，效果也較為理想，但仍有學者對其持保守態度，雖然此次我們的實驗結果與以往的一樣，支持流產與aPL之間的關聯，但我們同樣認為需要更多研究、更有說服力的數據，通過國際診斷共識標準的確定或標準化核心實驗室檢測結果的發布，進一步的確定檢測和治療方案。