囊胚發育速度及形態學評分對凍融胚胎移植周期單囊胚移植結局的影響

張怡，嚴思思，丁錦麗，楊菁

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，湖北省輔助生殖與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430060)

隨著培養體系的改善，囊胚移植逐漸得到廣泛應用，與卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植有利于篩選發育潛能更佳的胚胎，移植后著床及活產率更高[1]。而單囊胚移植因可保證與雙囊胚移植相近的成功率并可降低多胎妊娠率、早產率等并發癥而被越來越多的中心所接受[2-3]。挑選一個發育潛能良好的囊胚是選擇性單囊胚移植成功的關鍵因素之一，但目前預測囊胚的發育潛能主要依據囊胚的發育速度及形態學評分，其選擇的標準尚存在爭議[4-5]，而關于D5及D6日囊胚移植成功率的差異，以及內細胞團和滋養層細胞與妊娠結局的關系并無明確答案。本研究通過回顧性分析本中心近2年來行凍融胚胎移植(FET)周期選擇性單囊胚移植的患者資料，綜合分析比較囊胚發育速度及形態學評分對移植結局的影響，以探討單囊胚移植的優化策略。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年1月至2018年6月在武漢大學人民醫院生殖醫學中心行FET周期單囊胚移植的患者。排除年齡>35歲、內膜轉化日子宮內膜厚度<7 mm及行PGD/PGS者。按照上述標準共納入296個周期。

二、方法

1.囊胚培養及評分：體外受精第3日，將移植及冷凍后剩余胚胎逐一轉移至囊胚培養液，在37℃、6% CO2培養箱中繼續培養，于受精后第5及6日觀察胚胎，按照Gardner評分系統對囊胚進行評級。優質囊胚的標準定義為3期及3期以上、內細胞團(ICM)及滋養層(TE)細胞均為B級及以上者；可利用胚胎定義為3期以上、ICM和TE評分不同時為C者。選取優質胚胎及可利用胚胎進行冷凍，用于FET周期囊胚移植。

2.囊胚冷凍與復蘇：囊胚冷凍前行激光皺縮，2 h內進行玻璃化冷凍。冷凍/解凍液購自日本加藤公司，室溫下將囊胚放入平衡液中5 min，然后將囊胚轉移至玻璃化冷凍液中，60 s內將囊胚放置于冷凍載桿上，迅速浸入液氮中保存。解凍時將載桿浸入37℃解凍液中，1 min內將胚胎轉移至稀釋液中作用3 min，后依次在洗滌液1、2中作用5 min，將胚胎轉移至囊胚培養液中，37℃、6%CO2環境中培養，等待囊胚移植。

3.內膜準備與囊胚移植：采用人工或自然周期準備內膜，囊胚移植在腹部超聲引導下進行。移植后第12日查血HCG，移植后30 d行B超檢查，見宮內孕囊者為臨床妊娠。

三、觀察指標

患者一般資料；臨床妊娠率(臨床妊娠例數占總FET周期數的百分比)；孕早期流產率(孕3月內流產例數占妊娠例數百分比)；繼續妊娠率(孕3月后妊娠例數占FET周期數的百分比)。并對FET周期單囊胚移植妊娠結局影響因素進行二分類Logistic回歸分析。

四、統計分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。均數比較采用t檢驗或方差分析，率的比較采用卡方檢驗，并采用二分類Logistic回歸分析對相關參數對臨床妊娠率的影響進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般資料

本研究共納入296個周期。接受囊胚移植患者平均年齡為(32.6±5.1)歲，囊胚復蘇存活率為100%，臨床妊娠124例(41.9%)，孕早期流產15例(12.1%)，繼續妊娠109例(36.8%)；其中，多胎妊娠2例(0.7%)、異位妊娠3例(1.0%)。

二、囊胚發育速度對妊娠結局的影響

在所納入移植周期中，130例(43.6%)患者移植第5日(D5)囊胚，166例(56.4%)患者移植第6日(D6)囊胚。D5組與D6組患者年齡、內膜準備方案構成及內膜厚度比較均無統計學差異(P>0.05)。其中D5組優質囊胚62例(47.7%)，D6組優質囊胚49例(29.5%)，D5組優質囊胚比例顯著高于D6組(P<0.05)。

移植優質囊胚者，D6組孕早期流產率、臨床妊娠率、繼續妊娠率均稍高于D5組，但無統計學差異(P>0.05)；移植非優質囊胚者，D5組臨床妊娠率及繼續妊娠率稍高于D6組，但亦無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同發育速度單囊胚移植結局比較[n(%)]

三、形態學評分對臨床妊娠的影響

根據ICM及TE評分將單囊胚移植患者分為優質囊胚組及非優質囊胚組，其中非優質囊胚組進一步細分為ICM/TE評分B/C及C/B兩個亞組。三組間患者年齡、內膜準備方案構成及內膜厚度均無統計學差異(P>0.05)。

對于移植非優質囊胚者而言，ICM/TE評分為C/B者臨床妊娠率及繼續妊娠率均顯著低于優質囊胚組(P<0.05)，早期流產率升高，但無統計學差異(P>0.05)；而B/C組臨床妊娠率與移植優質囊胚者相比無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 形態學評分對單囊胚移植結局的影響[n(%)]

注：與優質囊胚組比較，*P<0.05

四、臨床妊娠影響因素分析

采用二分類Logistic回歸分析。在校正可能的混雜因素影響之后，ICM評分對臨床妊娠結局存在顯著影響[OR=0.12，95%CI(0.03，0.56)，P=0.007]，而囊胚TE評分、發育速度等則無顯著影響(P>0.05)(表3)。

表3 單囊胚FET臨床妊娠影響因素分析

討 論

本研究主要分析了不同發育速度及不同質量的囊胚FET臨床結局的差異。研究發現，囊胚發育速度與FET臨床妊娠率無顯著相關性，無論是移植優質囊胚還是非優質囊胚，D5日與D6日單囊胚移植者臨床妊娠率、孕早期流產率及繼續妊娠率均無顯著差異。Logistic回歸分析結果也顯示臨床妊娠結局與胚胎發育速度無關。然而，當對ICM評分不同的非優質囊胚進行亞組分析時發現，ICM評分為C的非優質囊胚臨床妊娠率及繼續妊娠率均顯著低于優質囊胚，孕早期流產率也有增加的趨勢；而ICM評分為B級的非優質囊胚臨床妊娠率與優質囊胚相當，這與Logistic回歸分析結果相一致——ICM評分與臨床妊娠結局相關，而TE評分則無此影響。在Logistic回歸分析模型中，為排除其他混雜因素的影響，亦將囊胚擴張程度、取卵時患者年齡、FET周期內膜準備方案及內膜厚度納入模型中，并未發現上述變量與妊娠結局相關，表明內細胞團評分是影響單囊胚移植妊娠結局的獨立因素。

囊胚發育速度被認為是反映胚胎質量的指標之一。曾有研究表明，在鮮胚移植周期中，D5囊胚移植臨床妊娠率高于D6囊胚，但目前尚不清楚這一結果究竟與囊胚發育潛能還是子宮內膜容受性降低有關。FET周期降低了子宮內膜容受性對移植結局的影響，可更好地判斷囊胚發育速度與囊胚發育潛能的關系，但D5與D6囊胚移植結局是否存在差異仍有分歧。Irani等[6]回顧性分析了701名活檢后移植行整倍體單囊胚移植周期的妊娠結局，D5囊胚著床率及活產率均高于D6囊胚。有研究則表明，對于移植優質囊胚者，D5及D6囊胚可獲得相近的妊娠率及著床率，但對于移植非優質囊胚者，移植D5囊胚結局明顯優于D6囊胚，這可能與D6囊胚非整倍體率發生率相對較高有關[7-9]。另有研究發現，囊胚復蘇周期移植成功率主要與囊胚質量有關，而與囊胚發育天數無關[10]。在本研究中，對于移植優質單囊胚患者，D5及D6臨床妊娠結局無顯著差異；而對于移植非優質單囊胚者，盡管D5囊胚臨床妊娠率較D6囊胚無顯著差異，但有升高的趨勢。尚有待進一步擴大樣本量進行分析。

有關囊胚形態學評分對囊胚發育潛能的預測價值目前也存在眾多爭議。近年來研究表明，囊胚滋養層細胞在預測妊娠結局方面效果更佳，與持續妊娠率密切相關[11]。甄璟然等[12]對141個單囊胚復蘇移植周期分析發現，在女性年齡、ICM質量及TE質量三個變量中，TE評分對臨床妊娠有最大預測價值；Honnma等[13]及國內學者陳清汾等[14]也發現，對于非優質胚胎而言，滋養層細胞形態學評分低者妊娠率降低、流產率升高。這可能與囊胚滋養層的功能有關——滋養層細胞在胚胎著床過程中是分化發育成胎盤的部分，與胚胎著床相關[15]。但亦有研究表明，ICM評分越高，整倍體囊胚所占比例越低，與囊胚發育潛能相關[16-17]。在本研究，并未發現TE評分與移植結局之間的顯著關聯，反之，對于非優質囊胚來說，ICM評分為C者臨床妊娠率及繼續妊娠率均低于移植優質囊胚者，間接表明相較于滋養層而言，內細胞團質量是決定胚胎發育潛能、影響臨床妊娠率的重要因素。為排除混雜因素對臨床妊娠結局的判斷，我們在Logistic回歸分析中同時納入年齡、內膜準備方案、內膜厚度等變量，并未發現上述因素對妊娠結局的影響。但有研究發現，高齡女性(≥39歲)囊胚移植成功率隨之下降[10]，這可能與年齡相關的非整倍體率上升有關。而囊胚發育天數、ICM評分及TE評分這三個變量中，僅ICM評分對妊娠結局存在影響，表明ICM是決定囊胚發育潛能的主要因素。

然而，本實驗仍存在一定的缺陷。首先，所納入的單囊胚移植周期數量較少，對于組間比較差異無顯著性的結果，仍需要擴大樣本量進行深入研究；此外，因部分病例為近期移植患者，僅能追蹤到移植后3個月結局，故僅對臨床妊娠率、孕早期流產率及繼續妊娠率進行分析，而活產結局仍有待進一步隨訪。

綜上所述，對于優質囊胚而言，囊胚發育速度對FET周期單囊胚移植結局影響不大；但對于非優質囊胚而言，囊胚發育速度的影響仍有待進一步探索，在本研究中，盡管D6囊胚與D5囊胚相比臨床妊娠率無統計學差異，但仍有一定程度的降低。故在進行胚胎移植時，可傾向于優先選擇內細胞團評分較高的D5囊胚，或將有可能提高臨床妊娠率。