多劑量復方苦參注射液對吉西他濱在大鼠體內藥物代謝動力學參數的影響

張 盛，彭代銀，陳衛東，孟子路，4，劉 李，5

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫藥大學藥物代謝研究所，安徽 合肥 230012;4.馬鞍山市人民醫院，安徽 馬鞍山 243000；5.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 210009)

肺癌是目前威脅人類健康的主要癌癥之一，其中大多數是非小細胞肺癌，其發病率為80%左右[1]，是臨床常見的一種惡性腫瘤疾病。由于該病早期缺少特異性的癥狀，大部分患者確診時已屬晚期，無法采用根治性手術進行治療。因此，臨床上主要以減緩患者痛苦和延長患者生存期的化學治療方式進行治療[2]。吉西他濱是細胞內胞嘧啶的類似物，可以阻斷腫瘤細胞DNA的合成，臨床上用于治療非小細胞肺癌，效果較佳，但是在化學治療過程中會出現一些不良反應[3]。文獻報道發現，復方苦參注射液可保護并提高機體免疫力進而提高化學治療療效[4]。而且，臨床上復方苦參注射液和吉西他濱注射液聯合使用后能減少患者不良反應和提高藥物療效[5]。目前，關于復方苦參注射液和注射用鹽酸吉西他濱溶液聯用減毒增效作用的內在原因尚未見報道。

在前期實驗[6]基礎上，本試驗旨在研究多劑量復方苦參注射液對注射用鹽酸吉西他濱在大鼠體內藥物代謝動力學參數的影響，以初步解釋臨床聯合使用復方苦參注射液和吉西他濱注射液治療疾病的減毒增效作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠由安徽醫科大學實驗中心[生產許可證號為SCXK(皖)2011-001]供給，自由飲食，循環光照12 h，適應性飼養至體質量(200±20)g，隨后隨機分為對照組和復方苦參注射液低、中、高劑量組。

1.2 主要試藥和儀器 注射用鹽酸吉西他濱(批號 H20030104，每支0.2 g)：江蘇豪森藥業股份有限公司；吉西他濱對照品(批號 100622-201202，純度≥98.0%)：北京中科質檢生物技術有限公司；復方苦參注射液(批號 20151131；5 mL×5支)：山西振東制藥股份有限公司；5-氟尿嘧啶(5-Fu，CAS號 51-21-8，純度≥99.0%)：阿拉丁工業公司(中國上海)；甲醇(色譜純)：上海星可高純溶劑有限公司；島津LC-15C高效液相色譜儀：日本島津公司；氮吹濃縮儀(MTN-2800D)：拜泰齊貿易上海有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；LC-4016型低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；XW-80A微型渦旋混合儀：上海滬西分析儀器有限公司；KQ-300B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；AB135-S型十萬分之一電子天平：德國METTLER TOLEDO。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)條件 色譜柱：Wondasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(3.5∶96.5)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：268 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸吉西他濱標準品和內標5-Fu標準品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，分別得到205 μg/mL鹽酸吉西他濱標準品溶液和215 μg/mL 5-Fu標準品溶液，作為對照品溶液，于4 ℃冰箱避光保存。

2.2.2 供試品溶液 根據注射用吉西他濱注射液說明書，取注射用吉西他濱粉末適量，用生理鹽水溶解并定量稀釋至每毫升約含吉西他濱2 mg的溶液，作為供試品溶液，用于大鼠尾靜脈注射，現配現用。

2.3 血漿樣品處理方法 將大鼠全血樣品250 μL置于肝素化離心管中，以3 000 r/min離心20 min后，取上清液100 μL，加入10 μL內標物，再加入300 μL甲醇進行蛋白沉淀，渦漩震蕩5 min后，3 000 r/min離心15 min，取上清液，40 ℃氮氣吹干，加入100 μL超純水復溶，渦漩震蕩2 min，15 000 r/min離心10 min，取20 μL上清液，HPLC分析。

2.4 標準曲線和定量下限 取不同濃度吉西他濱對照品溶液10 μL，分別加入空白血漿90 μL和濃度為22 μg/mL內標物10 μL，按濃度高低依次稀釋成濃度為200、150、75、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 μg/mL樣品，按照“2.3”項下方法處置，以血漿中待測物藥物濃度(X)及藥物峰面積與內標峰面積之比(Y)進行線性回歸，得回歸方程Y=0.017 4X-0.009 5(r=0.999)。結果表明，在0.781 25～200 μg/mL范圍內，回歸方程呈良好的線性關系。

2.5 方法專屬性 取大鼠空白血漿樣品，含內標和吉西他濱的大鼠空白血漿樣品，尾靜脈注射鹽酸吉西他濱的大鼠血漿樣品后加內標，按“2.3”項下條件處置，按“2.1”項色譜條件依次進樣，見圖1。結果表明，血漿中內源性物質不干擾吉西他濱及內標5-Fu的檢測。

注：A.空白血漿；B.空白血漿+內標+吉西他濱標準品；C.尾靜脈注射鹽酸吉西他濱后大鼠血漿+內標；1為5-Fu；2為吉西他濱

圖1 3種血漿樣品的HPLC圖

2.6 定量下限 按“2.3”項下方法處理配置成0.781 25 μg/mL的質控樣品，按“2.1”項條件依次進樣，以“2.4”項下標準曲線求得實際濃度，計算RSD為6.17%(n=5)。

2.7 精密度試驗

2.7.1 日間精密度 按“2.3”項下方法操作，按“2.1”項下條件依次進樣分析經血漿樣品處理后的高濃度(150 μg/mL)、中濃度(12.5 μg/mL)、低濃度(1.562 5 μg/mL)、定量下限(0.781 25 μg/mL)4個濃度的質控樣品，以“2.4”項下標準曲線求得實際濃度，得出RSD分別為8.62%、8.81%、5.0%、1.32%(n=5)。其準確度分別為114.9%、96.0%、101.3%、104.7%(n=5)。

2.7.2 日內精密度 按“2.3”項下方法操作，按“2.1”項下條件依次進樣分析，經血漿樣品處理后的高、中、低、定量下限4個濃度的質控樣品，以“2.4”項下標準曲線求得實際濃度，得出RSD分別為10.52%、8.56%、7.35%、6.25%(n=5)，其準確度分別為101.9%、99.3%、95.6%、103.3%(n=5)。

2.8 提取回收率 按“2.3”項下方法操作，配置高、中、低3個濃度的血漿樣品，按“2.1”項下條件依次進樣，記算吉西他濱與內標5-Fu峰面積比值(Ai)；配置3個相應濃度的吉西他濱和內標5-Fu的混合對照品溶液，按“2.1”項下條件用HPLC依次進樣，記算吉西他濱與內標5-Fu峰面積比值(A0)；按Ai/A0計算提取回收率，高、中、低3個濃度得提取回收率分別為95.05%、96.72.88%、98.26%(n=5)。

2.9 穩定性試驗 按“2.3”項下方法操作，按“2.1”項依次進樣分析經血漿樣品處置后的高、低兩個濃度的質控樣品，依次觀察血漿樣品在室溫12 h以及凍融3次的穩定性。以“2.4”項下標準曲線求得實際濃度，將測得濃度與標示濃度相比較，每一濃度的均值與標示濃度的RSD分別為8.1%、9.3%(n=5)。觀察置于-20 ℃ 1周情況下的長期穩定性，依次進樣測定。每一濃度的均值與標示濃度的RSD分別為6.0%、8.0%(n=5)。

2.10 藥物代謝動力學參數 取上述適應性飼養的雄性SD大鼠24只，體質量為(200±20)g。隨機分為對照組和復方苦參注射液高、中、低3個劑量組，每組6只。對照組大鼠尾靜脈連續注射生理鹽水10 d，復方苦參各劑量組大鼠尾靜脈連續注射復方苦參注射液10 d，對照組和復方苦參注射液各劑量組于最后一天給藥后5 min，尾靜脈注射吉西他濱溶液(溶媒為生理鹽水)，吉西他濱給藥劑量為20 mg/kg，復方苦參注射液高、中、低劑量組給藥劑量分別為3.6、1.8、0.9 mL/kg，給藥前禁食不禁水12 h。于吉西他濱給藥后1、3、5、10、15、30、60、120、240、360、480、600、720 min從大鼠眼底靜脈叢取血，置于肝素化離心管，按“2.3”項下方法依次進樣。對照組和復方苦參注射液低、中、高劑量組的藥時曲線見圖2；經DAS 2.0分析后得出其對應的藥物代謝動力學參數，見表1。

使用統計學軟件SPSS 23.0，采用單因素方差分析和非參數檢驗Nemenyi法進行統計學分析，在多劑量復方苦參注射液對吉西他濱在大鼠體內藥物代謝動力學參數影響中，與正常組比較，復方苦參注射液高劑量組AUC(0-t)和MRT(0-t)差異具有統計學意義(P<0.05)，表明同時使用復方苦參注射液與吉西他濱注射液時，多劑量復方苦參注射液可以增加吉西他濱注射液的濃度，并延長其平均滯留時間。

圖2 多劑量復方苦參注射液對鹽酸吉西他濱在大鼠體內平均血藥濃度-時間曲線的影響

組 別nt1/2α/mint1/2β/minCL/L/(min·kg)V/(L/kg)AUC(0-t)/[mg/(L·min)]MRT(0-t)/min對 照635.7±36.869.32±0.000.160±0.0400.001±0.00024 062.1±3 936.2260.7±53.7復方苦參低劑量669.3±0.069.32±0.000.187±0.0020.001±0.00027 805.6±8 513.1284.9±52.4復方苦參中劑量669.3±0.069.32±0.000.001±0.0000.065±0.01231 475.8±7 282.0271.8±39.0復方苦參高劑量640.1±33.369.32±0.000.162±0.0250.001±0.00139 081.6±9 120.4#389.6±87.9#

注：與對照組比較，#P<0.05；t1/2α(distribution half-life)：分布半衰期；t1/2β(elimination half-life)：消除半衰期；CL(clearance)：清除率；V(apparent volume of distribution)：表觀分布容積；AUC(area under curve)：血藥濃度-時間曲線下面積；MRT(mean residence time)：平均滯留時間

3 討論

肺癌是目前常見的癌癥之一，其中非小細胞肺癌約占80%，且發病率呈連續上升的趨勢[7]，臨床上首選個體化的化學治療方式進行治療。吉西他濱作為治療非小細胞肺癌的一線藥物，是新型的阿糖胞苷類似物，主要作用于S期細胞，從而達到抗腫瘤作用[8]，對晚期非小細胞肺癌化學治療效果較好，但是在化學治療的過程中，由于患者體質虛弱以及化學治療藥物具有一定的不良反應，如吉西他濱具有血液、淋巴、胃腸等不良反應[9]，因此，在臨床上吉西他濱作為化學治療藥物治療非小細胞肺癌受到了限制。復方苦參注射液是由苦參、山慈菇、靈芝、何首烏和土茯苓加工制成的純中藥制劑，實驗證實，復方苦參注射液可通過增強機體的免疫功能和抑制相關腫瘤血管生成因子，誘導腫瘤細胞凋亡而起到抗腫瘤作用[10]，同時可以降低患者使用化學治療藥物產生的不良反應[11]。

本研究結果表明，多劑量復方苦參注射液可以影響吉西他濱在大鼠體內AUC(0-t)和MRT(0-t)，可以增加吉西他濱的作用時間和藥物濃度，但不能確切說明與藥效的關系，因為吉西他濱在體內起藥效作用的是其代謝物[3]。根據藥物代謝動力學參數之間的關系分析，AUC(0-t)增加，半衰期延長，清除率和表觀分布容積下降，但本次實驗結果顯示，分布半衰期、消除半衰期、清除率和表觀分布容積都未有顯著變化，這可能是因為吉西他濱注射到體內，不存在吸收過程，直接進入血液，因此AUC(0-t)和MRT(0-t)更直觀表現出來；隨后，吉西他濱分布到組織，隨即由肝和腎在體內消除，分布半衰期和消除半衰期以及清除率是反映這個過程的參數，而這個過程受很多因素干預，如代謝酶、轉運體。一方面吉西他濱是以被動易化轉運的方式進入組織，轉運過程中被載體的競爭性底物所抑制[12]。另一方面，吉西他濱在進入機體內后一部分由脫氧胞苷激酶代謝變成活性的吉西他濱三磷酸鹽而發揮抗腫瘤作用，進而經體內代謝酶代謝排出體外，另一部分直接由體內代謝酶代謝后排出體外。目前，關于復方苦參與吉西他濱聯合使用與代謝酶的關系尚不明確，后期實驗將開展代謝方面的研究。

在以往研究中，單劑量復方苦參注射液與吉西他濱聯合使用后，吉西他濱在大鼠體內的藥物代謝動力學參數并未見有顯著改變[6]。但在本次研究中，多劑量復方苦參注射液與吉西他濱聯合使用后，吉西他濱的藥物代謝動力學參數發生了變化。與對照組相比，復方苦參高劑量組AUC(0-t)和MRT(0-t)顯著升高和延長(P<0.05)。中西藥的相互作用與代謝酶(尤其是CYP450酶)息息相關，有研究表明，復方苦參注射液可以改變細胞色素P450酶活性[13]。而按照復方苦參注射液臨床治療1個療程的劑量及大鼠與人體劑量折算公式推算，多劑量試驗中對大鼠連續給予復方苦參注射液10 d，由于連續多次給予復方苦參注射液，使其在體內蓄積，當蓄積到一定程度時，其體內藥物濃度增加，活性也相對增加，使機體物質發生改變，進而對吉西他濱藥物代謝動力學參數AUC(0-t)和MRT(0-t)產生了影響。這可能是兩者雙重影響的結果。

本研究結果表明，多劑量復方苦參注射液與吉西他濱聯合使用后，能夠顯著提高吉西他濱在大鼠體內的AUC和顯著延長MRT，提示兩者聯用使用可達到增效作用。此外，本試驗以臨床聯合用藥療效為出發點，其結果為后期深入研究二者聯合用藥的增效減毒機制提供參考，也為今后探討中藥復方聯合抗腫瘤藥物治療腫瘤，以及更深入地揭示腫瘤藥物的作用機制、耐藥機制奠定了基礎，并有利于研發新的抗腫瘤藥物。