綠萼梅藥材超高效液相色譜指紋圖譜研究

王燦燦，楊 沫，2，吳德玲，2，3，張 偉，2，3，金傳山，2，3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038；3.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

綠萼梅為薔薇科植物梅[Prunusmume(Sieb.)Sieb.et Zucc.]的干燥花蕾，具有疏肝和中、化痰散結(jié)之功效，用于治療肝胃氣痛、郁悶心煩、梅核氣、瘰疬、瘡毒等癥[1]。綠萼梅以長(zhǎng)江流域以南為多，如安徽、浙江、湖北等地，日本、朝鮮、新西蘭亦有分布[2]。綠萼梅始載于《本草綱目》，近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)綠萼梅化學(xué)成分進(jìn)行了相關(guān)研究[3-6]，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的成分中主要包括黃酮、苯丙素、揮發(fā)油等化學(xué)成分。有關(guān)綠萼梅藥材的質(zhì)量控制，目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的是多成分的含量測(cè)定[7-8]，而采用指紋圖譜技術(shù)評(píng)價(jià)和控制綠萼梅藥材質(zhì)量的研究報(bào)道很少，難以全面反映綠萼梅所含化學(xué)成分特征，難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和控制藥材質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)對(duì)綠萼梅藥材指紋圖譜進(jìn)行研究，UPLC具有耐高壓、快速分離、高靈敏度、高分離度等特點(diǎn)，能克服高效液相色譜靈敏度低、分析時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，在中藥等復(fù)雜體系的分離分析上具有明顯優(yōu)勢(shì)，被廣泛地應(yīng)用于中藥復(fù)雜體系的研究。利用UPLC建立綠萼梅的指紋圖譜，能縮短分析時(shí)間、節(jié)約溶劑消耗，可為建立綠萼梅藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent technologies 1290 infinity Ⅱ(G7120A二元泵系統(tǒng)，G7167B自動(dòng)進(jìn)樣器，G7114B VWD檢測(cè)器)：美國(guó)安捷倫科技有限公司；BP211DS十萬分之一天平、BSA224S萬分之一天平：德國(guó)Sartorius公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；SYZ-C型石英自動(dòng)亞沸高純水蒸餾器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；F80型高速粉碎機(jī)：金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 試藥 對(duì)照品綠原酸(批號(hào) CF1026)：武漢天植生物技術(shù)有限公司；金絲桃苷(批號(hào)111521-201408)：中國(guó)食品藥品檢定研究院；異槲皮苷(批號(hào) 111809-201403)：中國(guó)食品藥品檢定研究院；蘆丁(批號(hào) YM0316SA13)：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純，其他試劑均為分析純。綠萼梅藥材采自安徽歙縣、浙江杭州，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為薔薇科植物梅[Prunusmume(Sieb.) Sieb. et Zucc.]的干燥花蕾。綠萼梅樣品來源和加工方式見表1。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取過四號(hào)篩的綠萼梅粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)充減失的質(zhì)量，混勻后過孔徑為0.22 μm的濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取金絲桃苷對(duì)照品、綠原酸對(duì)照品、異槲皮苷對(duì)照品、蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加50%的甲醇制成一定質(zhì)量濃度的母液，取單標(biāo)母液適量，加50%甲醇制成每毫升含金絲桃苷30.6 μg，異槲皮苷33.2 μg、綠原酸42.9 μg、蘆丁43.6 μg的混合對(duì)照品溶液。

表1 綠萼梅樣品來源和加工方式

2.2 色譜條件 Waters CORTECS C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，柱溫35 ℃；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，洗脫程序(0～6 min，6%→9% A；6～12 min，9%→13% A；12～16 min，13%→13% A；16～25 min，13%→30% A；25～30 min，30%→40% A)；進(jìn)樣量為1 μL；流速0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S4供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，各主要色譜峰的相對(duì)金絲桃苷峰(13號(hào)峰)的保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取S4供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材S4，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD都小于2.0%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 指紋圖譜的建立 將18個(gè)色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012.130723版)，先進(jìn)行數(shù)據(jù)剪切，以除去2 min前的溶劑峰和30 min之后色譜柱平衡的部分，設(shè)置S1為參照譜圖，對(duì)照譜圖的生成方法為中位數(shù)，時(shí)間窗的寬度為0.1，經(jīng)過多點(diǎn)校正之后，然后再進(jìn)行自動(dòng)匹配，生成綠萼梅藥材UPLC指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜(R)，分別見圖1、圖2。

圖1 綠萼梅藥材UPLC指紋圖譜

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 在上述數(shù)據(jù)處理的基礎(chǔ)上，采用國(guó)家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012.130723版)軟件對(duì)18批綠萼梅進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果表明相似度均>0.92，說明綠萼梅樣品相互之間相似度較好。

2.4.3 不同批次綠萼梅藥材指紋圖譜聚類分析 采用SPSS 23.0軟件包中的聚類分析程序?qū)Σ煌蔚木G萼梅提取物樣品進(jìn)行聚類分析。在方法上采用Euclidean距離計(jì)算，然后根據(jù)數(shù)值順序用Avergae linkage 法作圖、得出聚類分析樹狀圖，結(jié)果見圖3。

注：3.綠原酸；12.蘆丁；13.金絲桃苷；14.異槲皮苷

圖3 聚類分析的樹狀圖

由圖3可見，不同批次綠萼梅提取物可分為2個(gè)大類，S2、S4、S5、S6、S8、S10、S12、 S13、S14、S15、S16、S17、S18為一類，S1、S3、S7、S9、S11為一類，結(jié)果表明產(chǎn)地直接烘干和實(shí)驗(yàn)室直接烘干之間差異性很小，同時(shí)也表明了直接烘干與微波殺青后烘干這兩種加工方法之間存在一定差異。由于烘干是先使物體表面加熱，再經(jīng)熱傳導(dǎo)，使內(nèi)部溫度升高、水分散失緩慢的過程，產(chǎn)地直接烘干和實(shí)驗(yàn)室加工都屬于烘干，即二者差異性很小；微波干燥屬于穿透性加熱，能在短時(shí)間內(nèi)使物料干燥，直接烘干和微波殺青后烘干二者加工方式不同，干燥原理不同，即二者之間存在一定差異。聚類分析的結(jié)果與相似度計(jì)算結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的可靠性，可用于綠萼梅提取物的指紋圖譜分析。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)色譜條件中的色譜柱、流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察。考察了Waters公司的兩種UPLC色譜柱，一種是ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；另一種是CORTECS UPLC C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，最終選擇CORTECS C18色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水兩種流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相，樣品的分離效果較好。對(duì)260、355 nm不同波長(zhǎng)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在260 nm波長(zhǎng)下，圖譜的色譜峰信息較為全面，故選擇260 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)依次運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)和聚類分析方法對(duì)綠萼梅樣品UPLC指紋圖譜進(jìn)行分析，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，不同批次綠萼梅藥材的相似度都在0.900以上，表明不同批次綠萼梅樣品相似度良好；聚類分析時(shí)發(fā)現(xiàn)綠萼梅樣品聚為兩大類，由此發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地收集和實(shí)驗(yàn)室加工之間差異性很小(S1樣品除外)；烘干和微波殺青后烘干這兩種加工方式之間存在差異(S17樣品除外)，表明不同的加工方法對(duì)綠萼梅藥材質(zhì)量有一定的影響，在今后的綠萼梅藥材研究中需要規(guī)范其加工工藝，方能保證綠萼梅藥材的質(zhì)量。