參黃合劑對大鼠瘺管創(chuàng)面血管內(nèi)皮細(xì)胞信號通路的影響

王傳思，謝貽祥，姚 磊，黃鴻武，王永森

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科，安徽 六安 237005)

肛瘺是臨床常見病、多發(fā)病，手術(shù)是其主要治療方法，但創(chuàng)面修復(fù)緩慢[1]。為加速創(chuàng)面修復(fù)，各種生物制劑正在逐步應(yīng)用于臨床，但效果不確切，中醫(yī)藥因療效肯定而得到推廣應(yīng)用[2]。本課題組通過前期臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)，中藥參黃合劑能明顯減輕肛瘺術(shù)后疼痛，減少出血，促進創(chuàng)面愈合[3]。創(chuàng)面修復(fù)是一個多種細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程，而血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前所知對血管內(nèi)皮細(xì)胞激活作用最強的細(xì)胞因子，前期臨床研究亦發(fā)現(xiàn)參黃合劑對內(nèi)痔患者VEGF具有很好的調(diào)控作用[4]。目前，國內(nèi)外尚無公認(rèn)的肛瘺術(shù)后模型，筆者通過對污染性創(chuàng)面進行改良，模擬肛瘺術(shù)后局部微環(huán)境，建立大鼠體表瘺管模型，發(fā)現(xiàn)參黃合劑能夠促進創(chuàng)面血管生成及微循環(huán)改善[5]。本研究旨在探討不同時段參黃合劑熏洗對大鼠體表瘺管創(chuàng)面血管內(nèi)皮細(xì)胞信號通路的影響，為參黃合劑的進一步開發(fā)和研究提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠180只，清潔級，2月齡，體質(zhì)量(200±30)g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2014-0005]。

1.2 試劑和藥物 參黃合劑(由苦參、黃柏、孩兒茶、五倍子、烏頭、樟腦、冰片、制乳香、制沒藥組成，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院中藥房提供并制備)按4∶4∶2∶1∶2∶2∶3∶3質(zhì)量比混合，量取混合生藥180 g，加水500 mL，煎30 min(其中烏頭先煎，樟腦、冰片后下)，過濾濃縮至1.0 g/mL，4 ℃保存，給藥前復(fù)溫。生理鹽水(國藥準(zhǔn)字H20113297)：山東齊都藥業(yè)有限公司。高錳酸鉀(國藥準(zhǔn)字 H37022233)：山東省濟南康福生制藥有限公司。抗α-SMA單抗、抗鼠IgG 2α-過氧化物酶、DAB顯示液：武漢博士德生物工程有限公司；RT-PCR試劑盒：Promega公司；混合菌液(金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，批號 ATCC25922)和大腸埃希菌(批號 ATCC25912)：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院檢驗中心。

1.3 儀器 熒光定量PCR儀：Thermo PIKOREAL 96；MV2CP410攝像機、100倍光學(xué)顯微鏡、MetaMorph顯微圖像分析系統(tǒng)：北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司；酶標(biāo)儀：賽百盛GoldView；UV-754紫外分光光度計：浙江省杭州晶格科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制、分組及給藥 SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字法分為6組：空白對照組、空白模型組、模型對照組、生理鹽水組、高錳酸鉀組、參黃合劑組，每組各30只，按文獻(xiàn)[5]的方法用彈簧紗條埋置于SD大鼠頸背部并加混合菌液1×1010CFU/L，制成體表瘺管模型。20 d后拆除大鼠頸背部彈簧紗條，見瘺口有膿性分泌物者為模型復(fù)制成功?？瞻讓φ战M正常喂養(yǎng)，不作造瘺處理；空白模型組僅作造瘺術(shù)而不做瘺管切開掛線術(shù)；模型對照組僅作瘺管切開掛線術(shù)(使瘺管形成一個急性、開放、滲血、感染的創(chuàng)面，形成類似于臨床肛瘺術(shù)后創(chuàng)面)，不用任何藥物處理；生理鹽水組、高錳酸鉀組、參黃合劑組于瘺管切開掛線術(shù)后第1天開始，分別用生理鹽水紗條、高錳酸鉀溶液(1∶5 000)紗條、參黃合劑紗條濕敷創(chuàng)面30 min，每次治療前0.5 h在創(chuàng)面上滴加大腸埃希菌，每日上午、下午各1次，總療程14 d。

2.2 標(biāo)本采集 第1、7、14天從每組中隨機取10只大鼠，立即腹腔注射水合氯醛麻醉，拉脫頸椎法處死，取創(chuàng)面修復(fù)部位0.5 cm×0.5 cm大小肉芽組織，空白對照組取相同部位正常組織。標(biāo)本于甲醛溶液中固定24 h后，脫水，石蠟包埋，4 μm石蠟切片，58 ℃烤24 h。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測fms樣酪氨酸激酶插入嵌合受體/胎肝激酶-1(fms-like tyrosine kinase insert domain- containing receptor/fetal liver kinase-1，F(xiàn)LK-1/KDR)、4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-diphosphate ，PIP2)、3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate ，PIP3)表達(dá)水平 步驟：取蠟片，用二甲苯浸泡脫蠟，無水乙醇水化，PBS沖洗并阻斷，進行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液封閉，滴加一抗、二抗、鏈霉親和素-過氧化物酶，PBS多次沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢，每張切片選擇5個高倍鏡視野，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描后定量分析。

2.4 RT-PCR法檢測FLK-1/KDR、PIP2、PIP3 mRNA表達(dá)水平 各組大鼠麻醉后脫頸椎處死，取創(chuàng)面邊緣至創(chuàng)面中心寬約0.5 cm的創(chuàng)面邊緣修復(fù)肉芽組織，1.0 cm×1.0 cm大小，于預(yù)冷的乳缽中，加入1.0 mL變性液，迅速研磨成勻漿，用皮試針頭抽吸15～20次，使之成乳糜狀。采用RT-PCR方法檢測。PCR引物及內(nèi)參照由Invitrogen公司合成。各檢測指標(biāo)引物：

①β-actin熒光定量引物序列：正向引物 5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向引物5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，產(chǎn)物長度：150 bp。

②FLK-1/KDR引物序列：正向引物5′-CACACATCATCTTCTGTCCCAA-3′，反向引物5′-CTCTTCTCCCCTTTCCTTCTTA-3′，產(chǎn)物長度144 bp。

③PIP2引物序列：正向引物5′-GGTGTGGTCTTTCGTCCTTCTTA-3′，反向引物5′-GTCATCTGTCTCTCTGTCCTCTTGA-3′，產(chǎn)物長度152 bp。

④PIP3引物序列：正向引物5′-GGTGTGCTGTTTCCTCGTTCTTA-3′，反向引物5′-GTCATCTCTGTCTCTGTGCTGTTGA-3′，產(chǎn)物長度150 bp。

先從肉芽組織勻漿中提取RNA，置于PCR反應(yīng)管中逆轉(zhuǎn)錄cDNA，β-actin和目的基因體外擴增后通過1%瓊脂糖凝膠電泳(5 V/cm×30 min)分析PCR產(chǎn)物，檢測目的片段和β-actin加內(nèi)參片段相應(yīng)條帶的吸光度。吸光度的計算公式：A=lg(I0/I)=-lgT。式中A為吸光率，T為透光率，I0為入射光強，I為透過光強。靶基因mRNA相對表達(dá)量=靶基因吸光度值/β-actin吸光度值。

3 結(jié)果

除了空白對照組，其余5組大鼠創(chuàng)面PIP2、PIP3、FLK-1/KDR蛋白及其mRNA表達(dá)水平均隨術(shù)后時間的延長而明顯升高；術(shù)后14 d，其余5組上述指標(biāo)(除高錳酸鉀組PIP2 mRNA外)表達(dá)水平顯著高于術(shù)后1 d(P<0.05)。術(shù)后1、7、14 d，高錳酸鉀組和參黃合劑組FLK-1/KDR、PIP2、PIP3蛋白及其mRNA表達(dá)水平均高于空白對照組、模型對照組和生理鹽水組；術(shù)后7、14 d，參黃合劑組PIP2、PIP3、FLK-1/KDR蛋白及其mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白對照組、模型對照組和生理鹽水組(P<0.05)，部分指標(biāo)表達(dá)水平顯著高于高錳酸鉀組(P<0.05)。見表1、圖1。

4 討論

肛瘺占中國肛門直腸疾病總發(fā)病率的1.67%～3.60%，多是肛周膿腫潰后或切開引流排膿后，膿腔得以修復(fù)，由新生肉芽組織和結(jié)締組織填充，但由于原發(fā)內(nèi)口的存在，感染物不斷由內(nèi)口進入瘺道，使管腔不能完全閉合而形成由致密結(jié)締組織包繞的慢性病理性管道[7]。手術(shù)是目前國內(nèi)外治療肛瘺的主要方法，不管何種手術(shù)方式，均可造成創(chuàng)傷，從而形成一個開放、急性、滲血的肛瘺創(chuàng)面[8]。

表1 各組大鼠創(chuàng)面FLK-1/KDR、PIP2、PIP3蛋白及其mRNA表達(dá)水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與空白模型組比較，#P<0.05；與模型對照組比較，△P<0.05；與生理鹽水組比較，◇P<0.05；與高錳酸鉀組比較，□P<0.05；與術(shù)后1 d比較，aP<0.05；與術(shù)后7 d比較，bP<0.05

臨床研究發(fā)現(xiàn)，肛瘺術(shù)后多見濕熱內(nèi)蘊、經(jīng)絡(luò)瘀阻證，應(yīng)治以清熱祛濕、活血消腫法。既往研究表明，參黃合劑應(yīng)用于混合痔患者，可促進炎癥消退，減輕術(shù)后腫痛，縮短術(shù)后創(chuàng)面愈合時間[9]。參黃合劑可明顯縮短肛周膿腫、肛瘺術(shù)后患者的療程，促進創(chuàng)面組織修復(fù)和創(chuàng)面愈合[10]。

膿腫形成瘺管是一個慢性過程，采用長3 cm、外徑0.4 cm的彈簧內(nèi)置紗條置入大鼠肌層內(nèi)，再注入細(xì)菌，既可以使細(xì)菌與周圍組織廣泛接觸，又不會在拔除紗條時破壞管壁組織。局部病理檢查發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌液組的管壁組織結(jié)構(gòu)與臨床瘺管結(jié)構(gòu)相似，管腔周圍見肉芽組織明顯增生，大量成纖維細(xì)胞生成，炎性細(xì)胞浸潤和少量新生毛細(xì)血管，伴不均勻的內(nèi)層增生，每次治療前0.5 h在創(chuàng)面上滴加大腸埃希菌，以模擬肛瘺創(chuàng)面污染環(huán)境，使實驗更接近于真實臨床環(huán)境[6]。

有關(guān)創(chuàng)面修復(fù)的研究表明，VEGF分泌是創(chuàng)面修復(fù)時血管內(nèi)皮細(xì)胞激活的第一步。VEGF是目前所知作用最強的唯一特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的促血管生成的細(xì)胞因子，是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原。FLK-1/KDR是VEGF發(fā)揮促血管生成作用的主要功能性受體，具有明顯趨化性和促分裂活性。研究發(fā)現(xiàn)，純合子動物編碼FLK-1/KDR基因突變會減少已有的血管內(nèi)皮細(xì)胞以出芽方式生成的血管及其功能，而不影響間質(zhì)原位細(xì)胞分化為成血管細(xì)胞和血細(xì)胞生成[11]，這提示KDR是血管形成的主要調(diào)控因子。VEGF促血管生成的功能主要由其受體FLK-1/KDR介導(dǎo)，促進FLK-1/KDR的活化可有效促進VEGF的信號傳導(dǎo)，從而達(dá)到促進血管生成、促進肉芽組織生長的目的。VEGF通過細(xì)胞膜上KDR將細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)，激活下游磷脂酶C-γ-蛋白激酶C-快速加速纖維肉瘤-丁酮-有絲分裂原活化蛋白激酶(phospholipase C-γ-protein kinase C-rapidly accelerated fibrosarcoma-methyl ethyl ketone-mitogen-activated protein kinase， PLC-γ-PKC-Raf-MEK-MAPK)信號通路，將信號傳遞至核內(nèi)激活DNA的合成，促進內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[12]。KDR可以活化磷脂酶C-γ(phospholipases C-γ，PLC-γ)，隨后激活PKC信號通路。KDR的C端Tyr1175磷酸化后可與PLC-γ結(jié)合，使其磷酸化，增強催化活性。PLC-γ水解PIP2生成二酰甘油(adiacylglycerol，DAG)和PIP3，通過增殖途徑的信號傳導(dǎo)，促進血管生成和創(chuàng)面修復(fù)[13]。

注：上、中、下圖分別為FLK-1/KDR、PIP2、PIP3蛋白的電泳條帶。上層為β-actin，下層為目的基因，1、2、3、4、5、6為術(shù)后1 d空白對照組、空白模型組、模型對照組、生理鹽水組、高錳酸鉀組、參黃合劑組；7、8、9、10、11、12為術(shù)后7 d空白對照組、空白模型組、模型對照組、生理鹽水組、高錳酸鉀組、參黃合劑組；13、14、15、16、17、18為術(shù)后14 d空白對照組、空白模型組、模型對照組、生理鹽水組、高錳酸鉀組、參黃合劑組

圖1各組大鼠瘺管創(chuàng)面FLK-1/KDR、PIP2、PIP3 mRNA表達(dá)水平的電泳結(jié)果

本實驗將大鼠分成6組。從空白對照組獲取大鼠正常狀態(tài)，即基準(zhǔn)值?？瞻啄Ｐ徒M是大鼠體表瘺管模型復(fù)制成功后，無瘺管切開掛線術(shù)干預(yù)狀態(tài)，模擬人的肛瘺狀態(tài)。模型對照組為瘺管切開掛線術(shù)后自行愈合的狀態(tài)。生理鹽水組為瘺管切開掛線術(shù)后無藥物應(yīng)用的狀態(tài)。結(jié)果表明，在創(chuàng)面修復(fù)的不同時期，參黃合劑組創(chuàng)面局部FLK-1/KDR、PIP2、PIP3蛋白及其mRNA表達(dá)水平明顯高于生理鹽水組、空白模型組和模型對照組(P<0.05)，大部分指標(biāo)表達(dá)水平明顯高于高錳酸鉀組，提示參黃合劑對創(chuàng)面修復(fù)過程中FLK-1/KDR、PIP2、PIP3的表達(dá)具有較好的調(diào)節(jié)作用。參黃合劑通過調(diào)控信號通路的表達(dá)，明顯加速創(chuàng)面VEGF表達(dá)，促進創(chuàng)面愈合，提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。高錳酸鉀對創(chuàng)面組織修復(fù)的作用機制是利用溫?zé)嵝?yīng)，改善局部組織血液循環(huán)，控制痙攣收縮，減少炎性物質(zhì)分泌，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)面的目的。而參黃合劑的作用機制則更為廣泛，熏洗療法可使藥物直達(dá)創(chuàng)面，溫?zé)岽碳た墒箘?chuàng)面微血管擴張，血液循環(huán)加快，改善回流，同時增強白細(xì)胞釋放蛋白溶解酶，加速去除病灶處壞死組織。溫?zé)徇€能降低痛覺神經(jīng)的閾值，使組織松弛，具有消炎止痛、減少出血、促進組織修復(fù)、縮短術(shù)后創(chuàng)面愈合時間的作用。

本研究表明，參黃合劑能促進創(chuàng)面肉芽組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞信號通路相關(guān)因子FLK-1/KDR、PIP2、PIP3的表達(dá)，從而增強創(chuàng)面肉芽組織中VEGF的生成，其療效優(yōu)于高錳酸鉀。

參黃合劑對創(chuàng)面修復(fù)的影響是多信號多途徑的，本研究僅從增殖途徑加以驗證，今后應(yīng)從其他信號通路探究參黃合劑促進創(chuàng)面愈合的機制。