間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在皮膚損傷修復(fù)中的研究進(jìn)展

孫璇 ，毛念渝 ，劉明珠 ，董傳明 .南通大學(xué)杏林學(xué)院，江蘇南通 600；.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南通 600

皮膚約占人體表面積的70%，是人體最大的器官，具有保護(hù)身體、排汗、感覺溫度變化、同時(shí)還參與機(jī)體免疫反應(yīng)。常見的皮膚損傷包括創(chuàng)傷、燙傷、燒傷等，其中難愈性皮膚損傷以及損傷后引起的瘢痕，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體相關(guān)組織或器官生理功能的降低，嚴(yán)重瘢痕甚至可以導(dǎo)致畸形，給患者帶來極大的肉體和精神上的折磨，也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這也使得皮膚損傷的修復(fù)成為科研臨床工作者迫切想要解決的問題。近年來隨著再生醫(yī)學(xué)的蓬勃發(fā)展，干細(xì)胞治療已成為皮膚損傷最具潛力的治療手段之一。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)及分泌多種生物活性物質(zhì)的能力等，但是其作用機(jī)制和臨床療效還需更深入的論證探究[1]。間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，存在于體內(nèi)多種組織中，如骨髓、臍帶、羊水、胎盤、脂肪、女性經(jīng)血及其他組織中。研究結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞可能通過旁分泌外泌體(exosomes)來調(diào)控新生血管生成，促進(jìn)細(xì)胞增殖從而起到對(duì)皮膚損傷的修復(fù)作用。外泌體是干細(xì)胞分泌的脂質(zhì)分子膜包裹的小囊泡[2]，近幾年來的研究證實(shí)外泌體在皮膚組織損傷修復(fù)中起到關(guān)鍵作用。

1 皮膚損傷修復(fù)過程

皮膚損傷的修復(fù)是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，其修復(fù)過程主要包括5個(gè)階段，即：止血期、炎癥期、增生期、成熟期和重塑期。整個(gè)修復(fù)過程需要經(jīng)過緊密的細(xì)胞編排、整合、分化、遷移、增殖、凋亡等一系列過程才能恢復(fù)皮膚結(jié)構(gòu)的再生，其中一個(gè)重要步驟是重塑期時(shí)新生血管的生成，將直接影響修復(fù)效果[3]。

近年來細(xì)胞凋亡在皮膚損傷修復(fù)過程中的作用機(jī)制引起了研究人員的極大興趣，凋亡是由多基因控制的由細(xì)胞主動(dòng)爭(zhēng)取的有序變化的死亡過程，細(xì)胞在接受凋亡信號(hào)后，凋亡調(diào)控分子間的相互作用，活化蛋白水解酶，接著進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程。當(dāng)細(xì)胞的增殖與凋亡處于一定程度的平衡狀態(tài)時(shí)可以促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)，當(dāng)這種平衡被打破，便會(huì)引起皮膚損傷的異常愈合[4]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的分類

間充質(zhì)干細(xì)胞屬于多能干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞有很多種類，目前能夠從骨髓、脂肪、羊水、臍帶血等組織中分離提取間充質(zhì)干細(xì)胞。近年來，因其具有多分化潛能、免疫調(diào)節(jié)和自我復(fù)制及多種生物活性物質(zhì)的分泌能力等特點(diǎn)而逐漸引起人們的關(guān)注，可作為理想的種子細(xì)胞用于組織器官的損傷修復(fù)。

近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是細(xì)胞治療中最常見的間充質(zhì)干細(xì)胞類型。然而由于操作的侵入性強(qiáng)，提取的產(chǎn)量低，增殖速度慢等缺點(diǎn)限制了其可用性。近年來一種新型的間充質(zhì)干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)并分離提取，即經(jīng)血干細(xì)胞[5](menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)。子宮作為人體中具有超強(qiáng)再生能力的器官，其子宮內(nèi)膜會(huì)在婦女育齡期經(jīng)過500次左右有規(guī)律的脫落和再生。MenSCs即來源于女性月經(jīng)期間脫落的子宮內(nèi)膜，它通過月經(jīng)血排出體外。由于可以無創(chuàng)和安全地從所有育齡婦女中通過采集月經(jīng)血獲得[6]，因此，經(jīng)血干細(xì)胞具有巨大的臨床應(yīng)用前景。

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性問題

盡管間充質(zhì)干細(xì)胞移植在皮膚損傷修復(fù)領(lǐng)域顯示出良好的臨床應(yīng)用前景，但是直接移植間充質(zhì)干細(xì)胞仍然存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。在MSCs制備過程中要充分了解供者的年齡、健康狀況、既往病史及家族遺傳史，明確各項(xiàng)指標(biāo)是否符合要求，盡量避免MSCs的干擾因素，在制備儲(chǔ)存應(yīng)用過程中需保持無菌環(huán)境，排除受者的醫(yī)源性感染，建立嚴(yán)格的管理規(guī)范制度，保護(hù)好供者的安全、健康、權(quán)益問題[7]。

此外，MSCs表面主要組織相容性復(fù)合體抗原表達(dá)較弱，不表達(dá)HLA-DR等，受者的機(jī)體免疫系統(tǒng)不能充分識(shí)別這種未分化的細(xì)胞，所以當(dāng)異源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，引起細(xì)胞突變，增大了腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[8]。在移植過程中，間充質(zhì)干細(xì)胞如果沒有被完全打散，有就堵塞微小血管而導(dǎo)致血管栓塞，從而導(dǎo)致局部組織缺血壞死。

3 外泌體對(duì)皮膚損傷修復(fù)的機(jī)制

研究表明，真正到達(dá)損傷部位并增殖分化為特定組織類型細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞僅占很小的比例，間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行損傷修復(fù)的主要機(jī)制是旁分泌作用[9]。外泌體作為一種重要的旁分泌因子，在皮膚損傷修復(fù)中起到關(guān)鍵作用。

3.1 外泌體的生物學(xué)特性

外泌體是一種脂質(zhì)分子膜包裹的小囊泡，直徑約為70～160 nm。外泌體來源于細(xì)胞核內(nèi)體系統(tǒng)，由多囊泡體內(nèi)陷腔化形成并通過多囊泡體與細(xì)胞膜融合而釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。最早于1983年有研究人員[10]發(fā)現(xiàn)了外泌體的釋放，但直到發(fā)現(xiàn)外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)包括microRNAs、功能性蛋白質(zhì)等生物活性因子才激起了人們的興趣。自此，對(duì)于外泌體研究的興趣持續(xù)增加，研究方向包括了外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)介質(zhì)、疾病生物標(biāo)志物，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體或者治療的制劑。外泌體包括脂質(zhì)、膜、胞質(zhì)蛋白以及microRNA等物質(zhì)，這些成分使得外泌體成為細(xì)胞間通訊的重要途徑。外泌體是旁分泌的一個(gè)重要組成部分，它提供了一種非傳統(tǒng)非接觸的長(zhǎng)距離細(xì)胞間通訊方式。

越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞通過旁分泌外泌體，促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)。除此以外，外泌體還具有免疫抑制的功能，能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞中各種炎癥因子的分泌如白細(xì)胞介素（Interleukin,IL）IL-6/IL-10、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）TNF-α等，而又因其半衰期較長(zhǎng)，可考慮作為臨床疾病的無創(chuàng)或微創(chuàng)診斷手段，有效減少患者的痛苦[11]。

3.2 外泌體具有促進(jìn)血管新生的作用

血管再生是間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)的主要機(jī)制之一。血管再生包括動(dòng)脈、靜脈以及毛細(xì)血管的再生，主要是通過促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移來修復(fù)已損傷血管的內(nèi)皮細(xì)胞[12]。Zhang等[13]在促進(jìn)大鼠燙傷創(chuàng)面的愈合的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)來源于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體含有豐富的Wnt蛋白，它能活化β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)創(chuàng)傷后血管的重建新生和膠原蛋白合成,從而促進(jìn)皮膚損傷修復(fù)。Zhang等的研究表明，內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的外泌體可通過激活Erk1/2信號(hào)通路上調(diào)成血管基因如VEGFA，Cox-2，F(xiàn)GF2等的表達(dá)，增強(qiáng)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)新生血管形成，提高糖尿病大鼠難愈性皮膚傷口的愈合[14]。Wang等[15]獲取的外泌體來源于一種新近發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞，即女性月經(jīng)血的經(jīng)血源性子宮內(nèi)膜干細(xì)胞。通過microRNA芯片篩選后，發(fā)現(xiàn)microRNA-21表達(dá)最高,microRNA-21作用于靶基因PTEN,并激活下游的PTEN/Akt信號(hào)通路，發(fā)揮促血管新生和抗心肌細(xì)胞凋亡的作用。

3.3 外泌體具有抑制瘢痕形成的作用

皮膚損傷修復(fù)過程中的一個(gè)重要的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。在傷口愈合過程中，成纖維細(xì)胞有助毛囊的形成，從而降低皮膚愈合過程中瘢痕形成的幾率。另一個(gè)重要細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞，它在皮膚損傷修復(fù)過程中起到組織收縮的作用。但是在病理情況下，肌成纖維細(xì)胞的持續(xù)存在會(huì)引發(fā)皮膚創(chuàng)面過度收縮從而導(dǎo)致増生性瘢痕形成。

Fang等[16]研究表明，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在小鼠背部皮膚全層創(chuàng)面缺損模型中可通過減少肌成纖維細(xì)胞在皮膚損傷后的過度聚集，來抑制瘢痕形成。該課題組通過高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)外泌體中富含microRNAs，主要成員有miR-23a,miR-21等，通過阻斷TGF-β/SMAD2信號(hào)通路，減少膠原沉積，抑制肌成纖維細(xì)胞的形成，從而起到抑制瘢痕形成的作用。Hu等[17]在皮膚全層損傷模型中發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能刺激成纖維細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)膠原蛋白的合成，增加PCNA，cyclin-1，N-cadherin的表達(dá)，從而抑制瘢痕形成、促進(jìn)皮膚傷口的愈合。

4 外泌體制備過程中的問題

目前學(xué)者認(rèn)為獲得外泌體分離的金標(biāo)準(zhǔn)是超高速梯度離心法，但是所獲得的外泌體提取量并不充足，且耗時(shí)耗力效率低下，不適合大量制備。隨著研究工作的深入，緊接著有了外泌體提取盒的出現(xiàn)，外泌體提取盒一方面可以節(jié)約培養(yǎng)基另一方面也減少了操作步驟，但是其價(jià)格昂貴，未能大量應(yīng)用于臨床。期望在將來的研究中，可以找到外泌體提取盒的平價(jià)替代品。