山東道地藥材全蝎HPLC指紋圖譜研究

，，

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355)

中藥全蝎為鉗蝎科(Scorpion)動物東亞鉗蝎Buthus martensii Karch 的干燥全體，具有熄風(fēng)鎮(zhèn)痙，通絡(luò)止痛，攻毒散結(jié)的作用，臨床多用于治療小兒驚風(fēng)、抽搐痙攣、中風(fēng)、半身不遂、破傷風(fēng)等癥狀[1]。現(xiàn)代研究表明，全蝎中化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗菌、消炎等藥理作用[2-4]。中藥指紋圖譜作為一種對中藥多組分、多靶點整體分析的有效手段，具有系統(tǒng)性、特征性、模糊性和穩(wěn)定性的特點，成為國內(nèi)外認(rèn)同的現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制方法[5-7]。全蝎作為大宗動物類中藥，目前藥典收載的全蝎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有“性狀”、“顯微鑒別”、“浸出物”三部分，不能全面反映全蝎內(nèi)在質(zhì)量，因此可以考慮建立全蝎HPLC指紋圖譜，為全蝎質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供數(shù)據(jù)支持。本實驗采用液相色譜法，對全蝎不同產(chǎn)地10批樣品建立 HPLC指紋圖譜，為全蝎的質(zhì)量控制提供了一種直觀、簡便、有效的手段，為全蝎的成分研究和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器、試劑和藥材

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(檢測器型號：UV-L2400，日立公司)；色譜柱(ZORBAX SB-C18柱，粒度5μm，4.6×250mm×4.6mm，美國安捷倫科技公司)；乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號：20120823)；甲醇(色譜純，天津市四友卓越科技有限公司，批號：20121206)；磷酸(分析純，天津科工工貿(mào)有限公司，批號：100726)；乙腈(色譜純，美國TEDIA)；純凈水(娃哈哈公司)。

1.2 供試藥材

實驗中所有供試全蝎藥材分別采于山東省濟南千佛山、泰安泰山、濟南長清、煙臺龍口、淄博沂源等地的山區(qū)，均為野生活蝎，選擇成年蝎，剔除幼蝎，放到清水中沖洗干凈撈出，晾曬干燥，置-18℃冷凍72h，4℃低溫保存。藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室李峰教授鑒定，符合《中國藥典》2015年版一部規(guī)定，為正品全蝎。

2 方法和結(jié)果

2.1 全蝎HPLC指紋圖譜的建立

取山東淄博沂源全蝎樣品，粉碎過100目篩，精密稱取藥材粉末0.1g，置于錐形瓶中，分別選用25mL水、甲醇、乙醇、石油醚為提取溶劑，超聲振蕩提取30min，過濾，溶劑蒸干，以甲醇定容至5mL，0.45μm微孔濾膜濾過，進(jìn)行HPLC分析。

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱，粒度5μm，4.6×150mm×4.6mm，美國安捷倫科技公司，柱溫25℃，流動相為乙腈-水，流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL，檢測波長為210nm，洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

2.2 供試品溶液的制備

取全蝎凍干粉過100目篩，精密稱取藥材粉末0.1g置于錐形瓶中，25mL80%乙醇，超聲提取30min，過濾，溶劑蒸干，以甲醇定容至5mL，0.45μm微孔濾膜濾過，得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》軟件，對10批不同產(chǎn)地全蝎藥材進(jìn)行HPLC檢測，根據(jù)中藥指紋圖譜相關(guān)技術(shù)參數(shù)：保留時間、相對保留時間、色譜峰高、色譜峰面積、相對峰面積百分比等。其中，相對保留時間和相對峰面積百分比是中藥指紋圖譜的核心參數(shù)，是評價中藥指紋圖譜的重要指標(biāo)。以出峰時間、峰面積較為穩(wěn)定的16號色譜峰作為參照峰，進(jìn)行其他色譜峰RRT、RA的計算。

2.3.1 精密度試驗

精密稱取樣品粉末0.1g，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積占總峰面積1%以上的色譜峰的相對保留時間及峰面積。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積1%以上的色譜峰19個，其相對保留時間的RSD值為0.072%～0.920%，峰面積的RSD值為0.293%～2.578%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

精密稱取樣品粉末0.1g，按上述色譜條件，分別在0，2，4，6，8，10 h進(jìn)樣。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積1%以上的色譜峰19個，其相對保留時間的RSD值為0.074%～0.823%，峰面積的RSD值為0.572%～2.638%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.3.3 重復(fù)性試驗

精密稱取樣品粉末0.1g共6份，分別按上述色譜條件測定。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積1%以上的色譜峰19個，其相對保留時間的RSD值為0.146%～1.084%，峰面積的RSD值為0.765%～2.750%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

取不同產(chǎn)地lO批全蝎藥材，按2.2項供試品溶液的制備方法與2.1項色譜條件測定，記錄HPLC色譜圖，采用"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版)"進(jìn)行匹配和相似度分析，所得匹配圖譜見圖1、圖2。利用對所得HPLC圖譜進(jìn)行了共有峰的比對和標(biāo)定，排除陰性對照峰，確定19個共有特征峰，其共有峰面積占總峰面積的90%以上，選擇出峰穩(wěn)定性、分離度良好的16號色譜峰為內(nèi)標(biāo)參照峰。

注：1：濟南千佛山 2：濟南千佛山 3：泰安泰山 4：泰安泰山 5：濟南長清 6：濟南長清 7：煙臺龍口 8：煙臺龍口 9：淄博沂源 10：淄博沂源

圖1 不同產(chǎn)地全蝎藥材的HPLC色譜圖比對

圖2 不同產(chǎn)地全蝎藥材的HPLC對照譜圖

2.5 共有峰面積與非共有峰面積

以16號峰為內(nèi)標(biāo)參照峰，設(shè)峰面積為1，計算其他各共有峰的相對峰面積比值，分別為0.0925、0.1448、0.2296、0.3738、0.7045、0.8446、0.0282、0.0324、0.1026、0.0166、0.0211、0.2798、0.6653、0.0243、0.3685、1、0.0525、0.0184、0.2214，并將其數(shù)據(jù)作為全蝎指紋圖譜的鑒別特征。計算10批樣品圖譜中非共有峰面積占總峰面積的百分比，依次為9.18%、8.24%、9.44%、7.49%、9.18%、7.47%、8.99%、9.68%、6.23%、6.00%，均小于10%，符合中藥指紋圖譜要求。

3 討論

本研究通過對不同產(chǎn)地全蝎藥材HPLC圖譜的比對，建立了全蝎藥材的HPLC指紋圖譜，共確定了19個色譜共有峰。選擇出峰穩(wěn)定性、分離度良好的16號色譜峰為內(nèi)標(biāo)參照峰。19個共有峰面積均占總峰面積的90%以上，可見實驗所建立的全蝎HPLC指紋圖譜能夠較為全面的反映全蝎化學(xué)成分的分布，且能整體上反映全蝎藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。

由于本研究缺乏對照品和供含量測定使用的對照藥材，加之實驗時間、實驗條件的局限，所得到的指紋圖譜中參照峰的化學(xué)成分尚不明確，在今后的研究中可以將其進(jìn)行成分分離純化，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)確定其成分組成。盡管存在以上不足之處，但本研究依然為全蝎化學(xué)成分的研究、藥材質(zhì)量控制與評價提供了相關(guān)實驗依據(jù)。