不同產(chǎn)地厚樸的蛋白質(zhì)指紋圖譜研究

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(武漢工商學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065)

厚樸為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et Wils)，或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮。味苦、辛、性溫，歸脾、胃、肺、以及大腸經(jīng)，具有燥濕消痰，溫中下氣除滿的功效，臨床主要用于濕滯傷中，腕痞吐瀉，腹脹便瀉，痰飲咳喘以及食積氣滯等[1]。其主要產(chǎn)地位于四川、浙江、廣西、湖北、湖南等地。在中成藥中，采用厚樸配方的多達(dá)200多種[2]。聚丙烯酞胺凝膠電泳與其它分析手段相比具有分辨率高、性能穩(wěn)定、樣品不易擴(kuò)散、凝膠孔徑可調(diào)等優(yōu)點，是目前最常用的蛋白質(zhì)分子分離、分析手段。根據(jù)以上優(yōu)點，可對中藥進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，以電泳圖譜來標(biāo)示中藥種的特性[3]。厚樸飲片的指紋圖譜研究對其真?zhèn)蔚蔫b定以及區(qū)分不同產(chǎn)地的厚樸飲片提供了有利條件[4-6]。

本研究考察了不同產(chǎn)地厚樸飲片的電泳指紋圖譜研究，對厚樸飲片中的蛋白質(zhì)提取進(jìn)行鑒定。通過對提取液量、超聲破碎時間、超聲破碎功率、超聲破碎時間間隔進(jìn)行單因素實驗以及正交試驗得出厚樸飲片提取蛋白質(zhì)的最佳方法。最后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的結(jié)果，比較不同產(chǎn)地厚樸飲片的蛋白質(zhì)含量及分布的差異。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

研究材料：本研究所用不同產(chǎn)地厚樸藥材分別購于湖北省恩施GAP示范基地、四川、重慶等地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室張林碧教授鑒定為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalis Rehd.Et Wils.)的干燥樹皮、根皮和枝皮，俗稱“紫油厚樸”。

試劑：TEMED(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，丙烯酰胺(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，冰乙酸、溴酚藍(lán)(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，甲叉雙丙烯酰胺(Fluka分裝)，磷酸(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)，TRIS堿(DOW Chemical Company)，甘氨酸(BIOSHARP)，考馬斯亮藍(lán)G-250(Sanland Chemical Co,LTD)，過硫酸銨(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)，以上試劑均為分析純。

儀器：GZX-9070M型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，JY600型電泳儀、DYCZ-40D型電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

取湖北恩施利川厚樸飲片粉末1g，加20mL的樣品緩沖液后按照最佳提取蛋白質(zhì)的條件，超聲破碎提取30min，超聲間隔6s，功率250W。經(jīng)超聲破碎后于4℃條件下，3500r/mim離心20min，取上清液于EP管中，4℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.2.2 凝膠的制備

表1 蛋白質(zhì)電泳凝膠的配制

根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，按表1配制5%的濃縮膠和10%的分離膠，灌膠。

1.2.3 上樣與電泳

用20μL移液槍分別吸取20μL樣品與20μL 40%蔗糖溶液于潔凈的EP管內(nèi)，用移液槍吹打混勻后，沸水煮沸5min，用20μL微量進(jìn)樣器吸取20μL緩緩注入樣品槽內(nèi)。樣品添加完畢后開始電泳，電泳開始階段控制電壓80V，待樣品全部到達(dá)分離膠后，調(diào)整電壓至120V。待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)距分離膠底部約1cm時，關(guān)閉電源，停止電泳。整個過程約3～4h。

1.2.4 染色與脫色

電泳結(jié)束后，取出凝膠板，小心分開上下兩塊玻璃板，取出凝膠，用直尺刮去濃縮膠，保留完整的分離膠并標(biāo)記溴酚藍(lán)前沿。將凝膠浸于考馬斯亮藍(lán)G250染色液中，染色20min左右。染色后浸于脫色液中脫色，并經(jīng)常更換脫色液，至背景清晰。

1.2.5 蛋白質(zhì)電泳圖譜分析

將染色后的凝膠用蒸餾水沖洗后小心平鋪于凝膠紫外成像分析儀內(nèi)，調(diào)整好位置以便于拍照。打開Gel-Pro analyzer分析軟件，點擊拍照按鈕拍照，由于蛋白質(zhì)電泳圖譜是可見的，所以需要適當(dāng)減少曝光率至條帶清晰。拍照后保存圖片于電腦中，繼續(xù)用Gel-Pro analyzer軟件的1D-Gel分析系統(tǒng)，進(jìn)行條帶捕捉，以各譜帶光密度值OD值為縱坐標(biāo)，泳道中各譜帶的泳動距離Rf值為橫坐標(biāo)，繪制各譜帶泳動率圖譜[9]。

2 結(jié)果分析

2.1 蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜分析

pro-PAGE蛋白質(zhì)圖譜見圖1，由圖可以看出個不同產(chǎn)地的厚樸飲片蛋白質(zhì)PAGE圖譜均有明顯的條帶，且條帶的位置和條帶形狀沒有明顯的差異，其中2、4、5、條帶顯示較弱，可能是這幾種厚樸樣品中雜質(zhì)較多，導(dǎo)致其提取的蛋白質(zhì)濃度較低，致使其條帶不夠明顯。

1、2.湖北恩施利川厚樸飲片;3.蛋白質(zhì)marker;4.重慶南川厚樸; 5.為四川都江堰厚樸;6.湖北恩施雙鶴厚樸;7.湖北恩施利川厚樸 圖1 蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜

2.2 泳動率圖譜分析

Lane1、2湖北恩施厚樸飲片;Lane3蛋白質(zhì)marker;Lane4重慶南川厚樸;Lane5為四川都江堰厚樸;Lane6湖北恩施雙鶴厚樸;Lane7 湖北恩施利川厚樸 圖2 不同產(chǎn)地厚樸飲片蛋白質(zhì)譜帶泳動率圖譜

將膠板用凝膠成像紫外分析儀進(jìn)行成像，用Gel-Pro analyzer軟件對各譜帶進(jìn)行分析。以各譜帶光密度值OD值為縱坐標(biāo)，泳道中各譜帶的泳動距離Rf值為橫坐標(biāo)，繪制各譜帶泳動率圖結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，Lane1、2、6、7同種產(chǎn)地的厚樸飲片的泳動率差異很小，其峰高、出峰點以及峰面積都幾乎一致。蛋白質(zhì)是植物基因表達(dá)的產(chǎn)物，不同產(chǎn)地的厚樸飲片的蛋白質(zhì)電泳圖譜幾乎一致說明的這幾種不同產(chǎn)地的厚樸飲片均為同一品種，證實了不同產(chǎn)地同種物種遺傳物質(zhì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。Lane4、5不同產(chǎn)地的厚樸藥材的泳動率有明顯的差別，其峰高、出峰點以及峰面積都不一樣，可以辨別出不同產(chǎn)地的厚樸藥材。說明不同產(chǎn)地厚樸飲片含有不相同類型的蛋白質(zhì)，證明蛋白質(zhì)電泳可以部分分辨不同產(chǎn)地的厚樸飲片。

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)的提取是中藥指紋圖譜構(gòu)建中重要的一環(huán)，在實驗最開始的蛋白質(zhì)電泳中，由于提取出的蛋白質(zhì)含量過低，導(dǎo)致無法跑出達(dá)到要求的電泳圖譜。因此進(jìn)行三因素三水平的正交試驗選出最佳的提取條件：超聲破碎時間40min，超聲破碎時間間隔4s，超聲破碎功率360W，提取液量17.5mL，蛋白質(zhì)提取濃度達(dá)到最大為4.98μg/mL。查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知達(dá)到了蛋白質(zhì)電泳的含量要求。

通過將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳實驗，得到蛋白質(zhì)電泳，可以部分分辨出不同產(chǎn)地的厚樸飲片，不同產(chǎn)地厚樸飲片蛋白質(zhì)條帶對應(yīng)的泳動率差異非常小，可以區(qū)別不同產(chǎn)地的厚樸飲片為不同一品種。