甘氨酰谷氨酰胺有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定與合成

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(山東威高藥業(yè)股份有限公司，山東 威海 264210)

甘氨酰谷氨酰胺 (Glycyl Glutamine，1)，化學(xué)名稱為(S)-5-氨基-2-(2-氨基乙酰基)氨基-5-氧代戊酸一水合物，是人工合成的谷氨酰胺的衍生物，在體內(nèi)迅速分解成谷氨酰胺而起作用。甘氨酰谷氨酰胺具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、水溶性強、能耐受熱消毒的特點，靜脈輸入后在肽酶的作用下迅速水解為甘氨酰和谷氨酰胺，并被充分吸收利用，對機體無任何毒副作用，是谷氨酰胺是代謝前體和理想替代品，也是復(fù)方氨基酸(15)雙肽(2)注射液中的雙肽化合物之一，有助于蛋白質(zhì)的合成和氮平衡的改善[1-2]。

目前甘氨酰谷氨酰胺的合成工藝有：以谷氨酰胺經(jīng)過?；桶被磻?yīng)精制得到[3]；或?qū)⒏拾彼徇M行保護后與谷氨酰胺反應(yīng)合成[4-6]等。甘氨酰谷氨酰胺的工藝雜質(zhì)隨合成路線不同而有差異，但降解雜質(zhì)殊途同歸。王珍珍等發(fā)現(xiàn)甘氨酰谷氨酰胺的水溶液隨著溫度升高和加熱時間延長，有關(guān)物質(zhì)A環(huán)(甘氨酰-谷氨酰胺)和焦谷氨酸的含量均顯著增加[6]。這兩個雜質(zhì)均以列入甘氨酰谷氨酰胺的中國藥典2015年版質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，焦谷氨酸同時也是谷氨酰胺中的雜質(zhì)。

在甘氨酰谷氨酰胺的高溫降解研究中，我們發(fā)現(xiàn)主要雜質(zhì)除了已知上述兩個雜質(zhì)外，還有1個未知降解雜質(zhì)，經(jīng)LC-MS分析，未知單雜的分子量為186.1(m/z187.1[M+H]+)，并不是美國藥典中的有關(guān)物質(zhì)C甘氨酰谷氨酸，根據(jù)其分子量推測為環(huán)甘氨酰谷氨酰胺的水解產(chǎn)物，即有關(guān)物質(zhì)B。目前尚無這三個有關(guān)物質(zhì)A、B和C的合成路線報道，因此對它們進行合成研究具有重要意義。從結(jié)構(gòu)上分析，有關(guān)物質(zhì)A是環(huán)酰胺結(jié)構(gòu)，羧酸與胺的反應(yīng)一般需要縮合試劑或劇烈的反應(yīng)條件，而胺酯交換反應(yīng)一般條件溫和，收率較高，特別適合于分子內(nèi)的環(huán)合反應(yīng)。本文將甘氨酰谷氨酰首先轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的甲酯，在三乙胺的作用下發(fā)生胺酯交換反應(yīng)，即得到有關(guān)物質(zhì)A，它再經(jīng)過堿性水解得到有關(guān)物質(zhì)B，合成路線如圖1所示。有關(guān)物質(zhì)C的機構(gòu)類似與甘氨酰谷氨酰胺，以谷氨酸為起始物料，和氯乙酰氯反應(yīng)后再氨解就可以得到，合成路線如圖2所示。

圖1 有關(guān)物質(zhì)A、B的合成路線

Fig.1 Synthetic Route of Related Substance A and B

圖2 有關(guān)物質(zhì)C的合成路線Fig.2 Synthetic Route of Related Substance Ⅲ

將合成所得的有關(guān)物質(zhì)B加入到高溫破壞反應(yīng)液中，雜質(zhì)峰的峰面積顯著增加，因此確認本文中制備的B為高溫降解的未知有關(guān)物質(zhì)。

1 實驗部分

1.1 有關(guān)物質(zhì)A環(huán)-(甘氨酰-谷氨酰胺)

稱量8.01g 甘氨酰谷氨酰胺到100mL三口燒瓶中，加入25mL甲醇攪拌，0℃下滴加9.16g 二氯亞砜，滴加結(jié)束后，在0～5℃條件下反應(yīng)6h，TLC跟蹤反應(yīng)至基本無甘氨酰谷氨酰胺，減壓蒸干反應(yīng)溶劑，再加入16mL水?dāng)嚢枞芙獾玫降S色溶液，升溫至40℃向其中加入4.2mL三乙胺，保持40℃反應(yīng)4h，冷卻至室溫后，繼續(xù)冰水浴冷卻析出產(chǎn)物，過濾，得到析出的白色固體5.12g，將粗品加入25mL純化水，在60℃條件下攪拌溶解，熱過濾，濾液冷卻至0～5℃后攪拌2h，抽濾得到白色固體，40℃條件下真空干燥2.0 h，得到3.68g產(chǎn)物，收率為73%，純度99.8 %，[HPLC歸一化法：色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相0.05mol/L磷酸二氫鈉溶液(加磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)∶甲醇(10∶1)；檢測波長205nm；柱溫30℃；流速 1.0mL/min；進樣量10μL]。1H-NMR(600 MHz,D2O)δ:1.94～2.07 (m,2H,CH2),2.22 (t,J1=7.2Hz,J2=8.4Hz,2H,CH2),3.85(d,J=18.6Hz,1H,CH),3.96 (d,J=18.6Hz,1H,CH),4.05 (s,1H,CH)；13C-NMR(150 MHz,D2O)δ:28.68,29.79,43.65,53.73,168.29,169.42,173.74；ESI-MS m/z:208.1 [(M+Na)]+；IR 3510,2967,1691,1573,1510 cm-1。

1.2 有關(guān)物質(zhì)B環(huán)-(甘氨酰-谷氨酸)

稱量2.10g環(huán)-(甘氨酰-谷氨酰胺)，加入50mL 1N氫氧化鈉溶液，加熱至80℃反應(yīng)4h后，減壓蒸餾濃縮至5mL左右后，加入20g硅膠混合均勻，過硅膠柱，先用二氯甲烷洗脫，后采用梯度洗脫至二氯甲烷∶甲醇醇=1∶1，TLC檢測過柱樣品，收集產(chǎn)物組分，減壓蒸餾除去溶劑后，用甲醇∶乙酸乙酯(1∶2，25mL)重結(jié)晶，，40℃條件下真空干燥2.0h，得到白色固體0.81g，收率為38%，純度95.2%(檢測條件同上)。1H-NMR(400 MHz,D2O)δ:2.03～2.06(m,1H,CHH),2.34～2.43(m,2H,CH2),2.44～2.51(m,1H,CHH),3.93(s,2H,CH2),4.29(dd,J1=5.2Hz,J2=9.2Hz,1H,CH)；13C-NMR(100 MHz,D2O)δ:25.14,29.23,41.05,56.97,173.13,175.61,182.40；ESI-MS m/z:187.0712[(M+H)]+；IR3363,3255,2946,1667,1536,1423,1201 cm-1。

1.3 有關(guān)物質(zhì)C甘氨酰谷氨酸

將14.7g谷氨酸加入甲苯和純化水中，0℃下滴加80mL 10%氫氧化鈉溶液，加入結(jié)束后，控制溫度在-5～0℃滴加33.6g氯乙酰氯的甲苯溶液，同時補加10%氫氧化鈉溶液使反應(yīng)體系呈堿性，反應(yīng)結(jié)束后用鹽酸調(diào)pH值到3攪拌析晶，過濾干燥得N-氯乙酰谷氨酸15.6g。將23.8g碳酸氫銨加入到150mL氨水中，攪拌均勻后加入N-氯乙酰谷氨酸，加熱至45℃反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾至出現(xiàn)固體，加入純化水100mL加熱至50℃后再加入2.15g活性炭，熱過濾，將濾液加入100mL甲醇后冷卻至-10℃析晶12h，過濾收集析出的固體，再用水∶甲醇(1∶1，50mL)重結(jié)晶一次，干燥得到4.68g，收率23%，純度98.5%(檢測條件同上)。1H-NMR(600 MHz,DMSO) δ:1.78～1.84(m,2H,CH2),2.18～2.28(m,2H,CH2),3.49(d,J=3.6Hz,2H,CH2),4.14 (t,J=6.6Hz,1H,CH),8.28 (d,J=7.2Hz,1H,NH)；13C-NMR(150 MHz,D2O) δ:25.26,29.34,38.14,52.51,164.20,175.64,176.21；ESI-MS m/z:227.1 [(M+Na)]+；IR 3511,2921,1691,1608 cm-1。