大孔樹脂分離純化枸杞多糖的研究

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(南京科技職業學院 生物與環境學院，江蘇 南京 210048)

枸杞是一種傳統的滋補中藥，我國很多地方都種植枸杞。枸杞自身擁有豐富的氨基酸、類胡蘿卜素、微量元素，以及富有藥效功能的多糖和黃酮成分，其中枸杞多糖具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤，提高免疫力等作用[1-2]。Mao[3]等人發現枸杞對癌細胞的擴散具有抑制作用，王柏昆[4]等通過實驗證明10mg/kg枸杞多糖(LBP)對荷瘤小鼠抑瘤率達31%。因此枸杞的成分和藥理研究也成為人們研究的熱點之一。

為了提高枸杞多糖的產品純度和附加值，近年來，凝膠過濾層析已被較多應用于多糖的分離中。郭琦[5]采用水提醇沉法得到枸杞多糖，再經Sephadex G-150 凝膠色譜柱純化得 LBP3-I，環境掃描電鏡顯示LBP3-I 呈現高分支結構，主要呈鏈狀，且糖鏈間多相互纏繞聚集成環狀。大孔吸附樹脂也越來越多的被用到枸杞多糖的分離純化工作中，肖珊[6]考察了五種不同型號的大孔吸附樹脂對枸杞多糖的吸附純化效果，得到HPD300樹脂對枸杞多糖的除雜效果最好，除雜率高達 82.35%，多糖的保留率為69.66%。魯曉麗[7]考察了9種大孔吸附樹脂脫除枸杞多糖提取液中色素脫除的能力，在最佳工作條件下選擇的D318樹脂的多糖保留率、脫色率和蛋白清除率分別為85.49%、67.32%和58.76%。

本文以枸杞為原材料，利用熱水浸提法得到粗枸杞多糖提取溶液后，在前期工作的基礎上，采用大孔吸附樹脂對枸杞多糖進一步分離純化，并進一步探索大孔吸附樹脂的吸附動力學和熱力學機制，為枸杞的深提取加工提供理論基礎。

1 實驗原材料

枸杞：購買于當地上海華聯超市，產自寧夏，經熱水浸提溫度90℃；料水比1∶35(W∶V)，提取時間2 h后得到粗提取液。

大孔吸附樹脂：市售的5種大孔吸附樹脂具體物性參數見表1。

表1 不同大孔吸附樹脂的特性參數

2 實驗部分

2.1 實驗設備和儀器

實驗所用儀器和設備如表2所示。

表2 實驗儀器

2.2 實驗方法

2.2.1 大孔吸附樹脂預處理

準確稱取市售50 g的大孔吸附樹脂和100 mL酒精放入250 mL錐形瓶中，浸泡4h，并不時攪動，使樹脂充分溶脹。然后用5～8倍的乙醇沖洗至流出液加水稀釋不變混。乙醇處理后，再用去離子水清洗其中乙醇，直至將乙醇完全置換出來即可使用。

2.2.2 樹脂吸附量測定

將市售的5種大孔吸附樹脂，經預處理后，取濕樹脂1.0 g于50mL小三角瓶中，取枸杞粗提取液30mL，濃度為15g/L,于恒溫搖床中以150 rpm轉速于295k恒溫震蕩8h，每隔1h取上清液分析其中枸杞多糖的濃度，計算平衡吸附量qe=(mg/g)。qe=(C0-Ce)V/G,其中，式中C0和Ce分別為起始溶液和平衡溶液枸杞多糖的濃度(mg/mL),V為溶液體積(L),G為樹脂質量(g)。

2.2.3 枸杞多糖吸附的動力學曲線擬合

稱取1.0g樹脂，放入250mL錐形瓶中，分別加入配制好的含枸杞多糖5，10，15，20，30g/L的粗溶液25mL，在一定的溫度下150r/min吸附8 h，測定不同初始濃度下吸附達到平衡后枸杞多糖的吸附量。

2.2.4 紫外掃描分析

采用UV-1800型紫外分光光度計(島津企業管理中國有限公司)分析枸杞多糖的特征吸收峰，掃描范圍190～500nm，光徑1cm。

2.2.5 紅外掃描分析

使用傅立葉變換紅外光譜儀(VERTEX 80，德國Bruker)分析枸杞多糖的化學結構特征。掃描范圍4000～400 cm-1，分辨率為2.0 cm-1。得到的FTIR譜圖使用Origin 8.0科學作圖軟件處理。

2.2.6 樹脂再生

準確稱取經過預處理的濕樹脂1.0 g置于50 mL錐形瓶中，取20 mL初始濃度為25 g/L的粗枸杞多糖提取液，于恒溫搖床中以150 r/min的轉速于295 k恒溫震蕩8 h后，取上清液分析其中枸杞多糖的濃度。實驗結束，將多余料液丟棄，將樹脂用蒸餾水反復洗滌后瀝干，用90%乙醇浸泡樹脂，用量約為100 mL，于恒溫搖床中以150 rpm的轉速于295 k恒溫震蕩1 h。用水沖洗至pH為7.0左右，可進行下一輪重復操作。

3 結果與討論

3.1 枸杞多糖的紫外分析

將浸提得到的枸杞多糖在紫外190～500nm處進行紫外掃描，所得圖譜如圖1所示。

由圖1可以看出，在紫外200nm處為多糖的特征吸收峰，同時在紫外263nm處有一個特征吸收峰，推測其為核酸的吸收峰，表明提取的提取枸杞液中仍含有其他雜志，需要進一步分離純化。

圖1 枸杞多糖的紫外掃描圖譜

3.2 枸杞多糖的大孔吸附樹脂的篩選

實驗樹脂經預處理后，稱取濕樹脂1.0g于50 mL小錐形瓶，加入野生枸杞粗提取液30mL，枸杞多糖初始濃度為15 g/L，在恒溫搖床中以150 rpm的轉速于295k恒溫震蕩8 h，取上清液測定枸杞多糖濃度，計算樹脂的平衡吸附量qe=(mg/g)，結果如圖2所示。

圖2 不同吸附樹脂對枸杞多糖的吸附容量對比

從圖2可以看出，經搖床震蕩吸附達到平衡后，樹脂HPD300對枸杞多糖的平衡吸附量最大，為210.3mg/g。其次是DM301樹脂，吸附量可達190.8mg/g。因此，后續實驗選用HPD300樹脂對枸杞多糖對枸杞多糖進行分離純化。

3.3 枸杞多糖的大孔吸附樹脂吸附動力學曲線

稱取濕樹脂1.0g于50mL小三角瓶中，加入枸杞多糖提取液30mL，初始枸杞多糖濃度調節為15 g/L，于恒溫搖床中以150 rpm，295k條件下恒溫震蕩8 h，每隔1h取上清液，分析上清液中枸杞多糖濃度，繪制吸附動力學曲線，結果如圖3所示。

為了考察枸杞多糖在HPD300樹脂上的吸附平衡時間，采用靜態搖床吸附實驗，測定HPD300樹脂對初始質量濃度為25 g/L 的枸杞多糖的吸附動力學曲線，圖3可以看出，枸杞多糖在HPD300樹脂上的吸附量隨時間的推移，先是明顯增大，當吸附進行到180 min 時，吸附速率達到平衡，吸附量不再發生明顯變化，因此，樹脂 HPD300合適的吸附時間為180 min。其后采用90%乙醇對吸附在樹脂上的枸杞多糖進行解析，解析率可達90.9%。

圖3 枸杞多糖吸附動力學曲線

3.4 枸杞多糖吸附等溫曲線

稱取濕樹脂HPD300 1.0g于50mL小三角瓶中，加入粗枸杞多糖提取液30 mL，枸杞多糖初始濃度為15 g/L，于恒溫搖床中以150 rpm，295k條件下恒溫震蕩8 h，每隔1 h取上清液測定其中枸杞多糖濃度，結果如圖4所示。

圖4 枸杞多糖吸附Freundlich曲線

吸附等溫線描述大孔樹脂對枸杞多糖的吸附能力，對吸附行為的理論分析和熱力學計算有重要意義。以Langmuir吸附等溫方程擬合，結果可知：R2=0.98563。由圖4和表3可知，以Freundlich吸附等溫方程擬合，結果可知：R2=0.99702。由此對比可以看出，Freundlich吸附等溫方程擬合的相關系數R2值更加接近于1，因此表明樹脂對枸杞多糖的吸附更好的吻合Freundlich方程。在295 K吸附溫度下，樹脂的平衡吸附量qe約為343.71 mg/g，可見HPD300樹脂對枸杞多糖具有較高的平衡吸附量。

表3 HPD300吸附枸杞多糖Freundlich等溫方程

3.5 大孔吸附樹脂HPD300的再生

將經過熱水浸提之后的枸杞多糖的粗提取液，配置成初始枸杞濃度45 g/L溶液，固定床層析柱每輪上樣量15mL，每一輪吸附分離完之后，HPD300樹脂用90%酒清洗樹脂4個柱體積，去離子水沖洗大孔樹脂直至pH值為中性，重新上樣，進行下一輪操作，計算樹脂的工作再生率和多糖回收率，如表4所示。

表4 HPD300樹脂工作再生率

由表4可知，大孔吸附樹脂HPD300吸附分離工藝可以重復利用，樹脂經過分離純化五輪后，其再生效率可達85.09%，多糖回收率87.47%。樹脂的重復使用性能較好。

3.6 枸杞多糖的紅外吸收掃描

為了進一步研究樹脂提純后的枸杞多糖的特征結構，將大孔吸附樹脂解析得到的枸杞多糖進行紅外光譜分析，所得結果如圖5 所示。

圖5 枸杞多糖的紅外掃描光譜

由圖5可知，波長3385cm-1處的寬峰是由于 O-H 鍵伸縮振動峰引起的，表明多糖中存在分子內和分子間的氫鍵；1030cm-1內出現的強吸收峰是羧基的C-O對稱伸縮振動所引起的，這表明該糖組分都含有羧基基團；636 cm-1吸收峰為吡喃糖 β 型 C-H 變角振動的特征吸收峰，表明其組成單糖為β-吡喃糖，表明提純所得枸杞多糖均主要以吡喃糖構成[8]。

4 結論

本文采用熱水浸提法提取枸杞中多糖粗提取液，并采用大孔樹脂HPD300吸附劑枸杞提取糖液進行分離純化，并計算了樹脂的再生率，所得結論如下：

(1)大孔吸附樹脂HPD300對枸杞多糖的吸附容量最大，可達343.71mg/g,吸附平衡時間為4h，提純后的枸杞多糖純度提高。

(2)大孔吸附樹脂HPD300對枸杞多糖的吸附符合Freundlich等溫吸附方程，R2=0.99，吸附模型為多分子層吸附。

(3)大孔吸附樹脂HPD300吸附分離工藝可以重復利用，樹脂工作五輪后，其再生效率可達85.09%，枸杞多糖的回收率為87.47%。