Bacillus subtilisS21產抗菌脂肽分離鑒定及半固態發酵工藝初探

■田秋月 劉 杰 張 亮 胡美忠

（銅仁職業技術學院，貴州銅仁554300）

養殖業中抗生素濫用帶來抗生素殘留、耐藥菌出現等公共衛生問題，迫切需要尋找新的藥物來替代抗生素在養殖業中的應用。Surfactin和Fengycin是芽孢桿菌屬產生的脂肽。Surfactin是由七個氨基酸和β羥基脂肪酸鏈組成的環狀脂肽[1]，具有廣譜高效抗菌[2]、抗病毒活性[3]，對支原體和原蟲有顯著的抑制效果[4]，對畜禽具有很好的促生長、抗氧化、抗菌、增強機體免疫力及改善肉質品質等作用[5-6]，是一種潛在的新型綠色抑菌促生長飼料添加劑。Fengycin呈環狀結構，由β羥基脂肪酸鏈和十個氨基酸殘基構成，具有良好的抗絲狀真菌活性，可用來防治絲狀真菌污染[7]。

芽孢桿菌產生的抗菌脂肽Surfactin和Fengycin有區別于傳統抗生素的抗菌機制，不易產生耐藥性，且對耐藥菌株有良好的抑制效果[8]，在動物生產中具有替代抗生素的潛力，近年來受到關注，如都海明等[9]研究了枯草芽孢桿菌fmbj產抗菌脂肽對肉雞生產性能及免疫機能的影響，結果表明添加4 000 U/kg抗菌脂肽能促進肉雞的生長發育和提升免疫機能。翟少偉等[10]實驗了不同抗菌脂肽添加物對吉富羅非魚增重、血清生化指標的影響，結果表明抗菌脂肽添加物可提升吉富羅非魚增重，有利于其血清生化指標。

本文分離鑒定了一株枯草芽孢桿菌產的抗菌物質，并對其產量提升做了優化，以期為促進安全、環保新型飼料添加劑的開發提供思路，實現我國畜牧業健康安全可持續發展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基及菌種

landy培養基：葡萄糖20 g、酵母粉1 g、磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、L-谷氨酸0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸錳0.005 g、L-苯丙氨酸0.002 g、五水硫酸銅0.001 6 g、七水硫酸亞鐵0.001 5 g、水1 L、pH值7。

LB培養基：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g、純凈水1 L，pH值7.2。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S21，民族中獸藥分離純化技術國家地方聯合工程研究中心中獸藥微生物發酵研究室篩選鑒定，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 25923），購自 Ameri?can type culture collection。

1.1.2 主要儀器

超凈工作臺（ZHJH-C1214C，上海智城）；安捷倫1100型液相色譜儀；安捷倫G6400液質聯用儀；高壓滅菌鍋（HVE-50，北方華粵）；pH計（DELTA 320，上海閔勝）；恒溫培養箱（BPH-9042，上海一恒）。

1.2 方法

1.2.1B.subtilisS21產抗菌脂肽發酵生產及初步分離

吸取微量-70℃保藏的B.subtilisS21菌液，轉置于LB培養基，37℃過夜培養至菌長出，接種環沾取微量菌液于LB固體培養基劃線培養，待長出菌落，挑取長勢良好的單菌落接種于landy培養基，37℃培養12 h作為種子液，種子液按1%（v/v）接種于landy培養基，180 r/min，37 ℃培養36 h，得發酵液。用3 mol/l HCl調節發酵液pH值至2，攪拌均勻后，靜置于4℃下12 h后，8 000×g離心得沉淀，沉淀加入原發酵液0.5倍體積甲醇（調節pH值至7），磁力攪拌10 min，8 000×g離心得上清液，重復甲醇萃取沉淀一次，合并甲醇萃取液，旋轉蒸干，殘渣用少量蒸餾水溶解，得粗抗菌脂肽提取物。

1.2.2B.subtilisS21產抗菌脂肽純化

粗抗菌脂肽初提物使用LH-20進一步分離純化，洗脫液為純甲醇，流速1 ml/5 min，以金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）做為指示菌，采用瓊脂擴散法（制備帶金黃色葡萄球菌平板，5 mm打孔器打孔，孔中加入洗脫液80 μl，37℃下培養24 h后測量抑菌圈直徑）檢測各管洗脫液的活性，得抗菌脂肽精提物。

1.2.3 抗菌脂肽鑒定

抗菌脂肽精提物使用安捷倫1100型液相色譜HPLC檢測，色譜條件：色譜柱5 TC-C18；波長210 nm；流速1 ml/min；時間0～20 min；90%乙腈-90%乙腈(有機相和水相均含0.1%三氟乙酸)。使用安捷倫G6400三重四極桿質譜聯用儀進行質譜鑒定，根據質譜圖推斷其結構。

1.2.4B.subtilisS21產Surfactin非無菌半固態發酵初探

前期探索性實驗發現，利用黃豆作為主要培養基質，采用半固態發酵方式，B.subtilisS21產Surfactin產量比使用landy培養基高出50～100余倍。經過查閱文獻，結合實驗過程中的經驗發現，是否添加碳源（從葡萄糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖四種碳源中選擇最佳的葡萄糖）和無機鹽體系（七水硫酸鎂0.5 g/l、氯化鉀0.5 g/l、硫酸錳0.005 g/l、五水硫酸銅 0.001 6 g/l、七水硫酸亞鐵0.001 5 g/l，選自landy培養基的無機鹽體系）對Surfactin產量影響極為明顯；另外，發酵時間和溫度對Surfactin產量也有影響，故采用Minitab軟件設計四因素三水平正交實驗篩選B.subtilisS21產Sur?factin的半固體發酵最佳方法，因素水平見表1。

表1B.subtilisS21半固體發酵培養因素水平

Surfactin液相檢測色譜方法：色譜柱5 TC-C18；波長210 nm；流速1 ml/min；時間：0～20 min；90%乙腈-90%乙腈(有機相和水相均含0.1%三氟乙酸)。同色譜條件下檢測精密配制的Surfactin（sigma）標準品梯度溶液含量，制作Surfactin標準品濃度與峰面積關系的標準曲線。

半固體發酵流程為：市售黃豆，粉碎成粗顆粒(1粒黃豆裂成約2～4片)，冷水蓋住黃豆浸泡12 h后蒸熟，趁熱把黃豆顆粒盛入用開水淋洗的帶蓋托盤，黃豆厚度約2～3 cm，待冷卻后，接入黃豆重量5%（v/g）的B.subtilisS21種子液，同時按表1所示的比例加入葡萄糖和無機鹽體系。

待發酵完成，使用甲醇萃取發酵的黃豆2～3次，合并萃取液，高效液相色譜法檢測甲醇萃取液中Sur?factin的峰面積，根據標準曲線計算其含量。

2 結果與分析

2.1 B.subtilisS21產抗菌脂肽的純化鑒定

2.1.1 Surfactin鑒定

抗菌脂肽精提物高效液相色譜HPLC檢測，得到圖1所示峰。從圖1可以看出，此抗菌脂肽提取物出現四個峰，保留時間與標準品Surfactin保留時間一致，初步判定此四個峰為Surfactin同系物。

圖1B.subtilisS21產抗菌脂肽高效液相色譜圖（A）及與Surfactin標準品對照圖（B）

B.subtilisS21產抗菌脂肽質譜鑒定結果見圖2，由圖2可知，出現了994.5、1 008.5、1 022.6、1 036.5四個＜M+H＞離子峰，之間相隔分子量為14，即CH2-，且分子量與Surfactin同系物一致，進一步判斷為Surfac?tin同系物。

選擇液相圖中保留時間靠后的三個峰進一步進行質譜分析，結果見圖3（A,B,C），從圖3（A）可知，出現了＜M+H＞為1 008.9的加 H 離子峰，＜M+Na＞為1 030.7的加Na離子峰，從圖3（B）可知，出現了＜MCH2+H＞為 1 022.6的 H 離子峰，＜M-CH2+Na＞為1 044.5的加Na離子峰，從圖3（C）可知，出現了＜MCH2-CH2+H＞為1 036.5的H離子峰，＜M-CH2-CH2+Na＞為1 058.3的加Na離子峰。對1 008.5、1 022.6、1 036.5進行二級質譜鑒定，結果見圖3(a,b,c)，根據二級質譜裂解碎片及文獻資料[11-13]，可以推斷出此抗菌脂肽結構為：β-OH-C13-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。分別計算對應分子量1 007、1 021、1 035。其中第七位Leu還有可能為Ile，具體是哪一個氨基酸殘基有待進一步分析，推斷過程見圖3a、b、c所示。

一級質譜中出現的994加H離子峰，根據Surfac?tin同系物相差CH2-的特性，推斷其結構為β-OHC12-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。

綜合所得，B.subtilisS21產Surfactin的四種同系物為：β-OH-C12-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。

2.1.2 Fengycin鑒定

在對B.subtilisS21產粗抗菌脂肽的抑菌譜實驗中發現（數據未列出），B.subtilisS21產粗抗菌脂肽對黑曲霉表現出抑制活性，證明B.subtilisS21產抗菌脂肽除了Surfactin（不具備霉菌抑制活性）外，還產生其他抗菌脂肽。在使用LH-20純化的某一管洗脫液質譜鑒定過程中（見圖4），出現了＜M+H＞為1 462.9的加H離子峰，＜M+Na＞為1 484.1的加Na離子峰，＜M-CH2+H＞為1 476.9加H離子峰，＜M-CH2+H＞為1 499.6的加Na離子峰，＜M-CH2-CH2+H＞為1 490.9加H離子峰，＜M-CH2-CH2+H＞為1 513.6的加Na離子峰，對＜M+H＞為1 476.9進行二級質譜，可以發現出現了1 109和995的加氫碎片離子，而1 108和994是Fengycin B的特征性片段[14-15]，故推斷此抗菌脂肽為Fengycin B（C14-16）,氨基酸殘基序列為 Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gln-Tyr-Ile。

2.2 B.subtilisS21產Surfactin非無菌半固態發酵初探

2.2.1 Surfactin標準曲線

采用液相色譜測定，得到了Surfactin標準品峰面積與濃度（mg/ml）的關系函數。

圖2B.subtilisS21產抗菌脂肽一級質譜圖

圖3B.subtilisS21產Surfactin鑒定流程

式中：y——峰面積；

x——濃度。

2.2.2 非無菌半固態發酵配方

采用Minitab軟件設計四因素三水平正交實驗，B.subtilisS21產Surfactin非無菌半固態發酵實驗設計及結果見表2。

從表2可以看出，影響B.subtilisS21產Surfactin的因子為D（發酵溫度）＞B（葡萄糖）＞C（發酵時間）＞A（無機鹽體系）。根據均值效應，可以得出此發酵條件下B.subtilisS21產Surfactin最佳的方法為A3B2C3D2，即無機鹽體系添加20%，葡萄糖添加5%，發酵時間48 h，發酵溫度37℃，驗證實驗表明此條件下Surfac?tin產量可達到4.02 mg/g，比原始landy培養基的產量22.1 mg/l(為B.subtilisS21菌株在landy培養基中Sur?factin的產量)增加了180余倍（landy培養基1 L按黃豆1 kg計）。

3 討論

芽孢桿菌產生的抗菌脂肽基于其抗菌抗病毒功效及安全無毒的特性，在醫藥、食品等領域有廣闊的應用前景，特別是在當今尋找動物生產中抗生素替代品領域具有很大潛力。芽孢桿菌產生的常見抗菌脂肽多種多樣，有Surfactin、Fengycin、iturin等[16-17]，抗菌脂肽有不同的同系物，不同的抗菌脂肽及同種抗菌脂肽的同系物其作用功效有區別，故為了科學利用芽孢桿菌產生的抗菌脂肽，就有必要弄清其結構[18]。芽孢桿菌產抗菌脂肽成熟的鑒定方法為質譜法，利用抗菌脂肽的特征碎片離子峰可以快速鑒定出其結構。

圖4B.subtilisS21產Fengycin鑒定過程

Surfactin典型結構為不同長度的β羥基脂肪酸鏈（一般為C13-15）和Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu通過內酯鍵連接而成的環狀結構，其斷裂片段為特征離子峰，β羥基脂肪酸鏈鏈長和七肽的氨基酸殘基組成在不同芽孢桿菌產生的Surfactin有可能不同，故Surfactin存在許多同系物，但主要存在兩種類型，即7位上的氨基酸是Leu或Val。Fengycin典型結構為不同長度的β-羥基脂肪酸鏈（一般為C14-18）和Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala(Val)-Pro-Gln-Tyr-Ile組成環狀結構，主要有Fengycin A和Fengycin B兩種，當肽鏈的6位上是Ala時，屬于Fengycin A；而當肽鏈的6位上是Val時，屬于Fengycin B[19]，在質譜鑒定上，主要看其裂解的特征離子峰，Fengycin A會出現1 080和966的特征峰，Fengycin B則會出現1 108和994的特征峰。

表2B.subtilisS21產Surfactin正交實驗設計

雖然Surfactin在醫藥、食品等領域有廣闊的應用前景，但是目前最大的問題是Surfactin產量低，且存在分離純化成本高的問題。目前Surfactin生產主要通過液態發酵生產，但是產量極低，野生株型產量達到30 mg/l已經是高產，且發酵過程會遇到發泡，液態發酵分離純化難等問題[20]，故針對芽孢桿菌代謝特點，利用半固態發酵可以杜絕發泡難題，且半固體發酵節省了固液（水）分離步驟，可直接使用有機溶劑固液萃取，解決了液態發酵分離純化難等難題，另外利用優勢菌群的原理，在非嚴格無菌狀態下可以完成發酵，能大量節省(如嚴格滅菌)成本。Surfactin產量上，一是利用誘變和分子生物學手段對菌種進行改造，二是篩選能大幅度影響Surfactin產量的關鍵培養基質，通過這兩種方法，Surfactin產量可以比野生菌株提高數百倍，本文利用關鍵培養基質黃豆，可輕易提升Surfactin產量百余倍。