體素內不相干運動DWI評估SD大鼠C6腦膠質瘤模型腫瘤微環境乏氧狀態

徐 曼，余永強，侯唯姝，潘紅利

(安徽醫科大學第一附屬醫院放射科，安徽 合肥 230022)

膠質瘤是一種瘤內微血管高度增生的原發性腦腫瘤，呈浸潤性生長，高表達血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)[1]。目前對于膠質瘤的標準治療方案為手術聯合放化療[2-3]，但患者預后較差[4]，膠質瘤微環境呈乏氧狀態是影響療效的主要因素[5-6]。既往主要采用檢測氧分壓、PET等評估膠質瘤微環境的乏氧程度，但氧分壓檢測為有創性檢查，PET具有輻射，且二者均不能動態評估乏氧狀態。體素內不相干運動DWI(intravoxel incoherent motion-DWI， IVIM-DWI)采用多個b值獲取系列DWI，可區分水分子擴散與血液灌注信息，反映活體內的微觀運動。本研究探討IVIM-DWI評估SD大鼠C6腦膠質瘤模型腫瘤微環境乏氧狀態的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇清潔級SD大鼠48只，雄性，體質量250～300 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：scxk(皖)2017-001]。本研究經我院動物倫理委員會論證并通過。

1.2 膠質瘤模型建立 對體外培養處于80%對數生長期的大鼠膠質瘤C6細胞進行消化，制備濃度為108/ml～1010/ml的細胞懸液備用。將SD大鼠麻醉后保定于定位儀，暴露術區顱骨，以冠狀縫前1 mm、矢狀縫右3 mm為鉆孔點鉆開顱骨。采用微量注射器抽取C6細胞懸液10 μl，自鉆孔點進針至硬腦膜下6 mm時后退1 mm，將細胞懸液緩慢注入大鼠腦實質，注射速度約1 μl/min，注射完畢停留5 min，拔針。封閉顱骨鉆孔，縫合切口，待大鼠蘇醒后送回動物房飼養。

1.3 儀器與方法 采用GE Discovery MR750W 3.0T MR 掃描儀，4通道實驗動物專用線圈。在造模第14、21及28天分別取大鼠16只，對其行頭部掃描，采集常規MRI及IVIM-DWI。FSE T1WI：FOV 6 cm×6 cm，矩陣256×256，層厚2 mm，間距0.5 mm，TR 2 532.1 ms，TE 24 ms； FSE T2WI：FOV 6 cm×6 cm，矩陣256×256，層厚2 mm，間距0.5 mm，TR 4 746 ms，TE 120 ms。IVIM-DWI：FOV 6 cm×6 cm，矩陣128×128，層厚2.4 mm，NEX 4，TR 3 000 ms，TE 102.4 ms，FA 90°，擴散敏感系數b值分別取0、10、20、50、100、200、400、600、800 s/mm2。

1.4 圖像分析 由2名影像科主治醫師閱片，意見不同時經協商達成一致。采用GE ADW 4.6工作站提供的MADC軟件對IVIM-DWI(圖1)進行后處理，在腫瘤實性成分最明顯的連續3個層面上勾畫ROI，避開出血及壞死區域，獲得參數ADC、純擴散系數(D)、偽灌注擴散系數(D*)及灌注分數(f)。

1.5 病理分析 每次MR掃描后處死大鼠，以4%甲醛溶液灌注心臟后取膠質瘤組織，石蠟包埋后切片，行HE染色及缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor-1α， HIF-1α)免疫組織化學染色(圖2)。

圖1 造模不同時間SD大鼠C6腦膠質瘤模型頭部IVIM-DWI偽彩圖 A～D.分別為造模第14天時ADC(A)、D(B)、D*(C)、f(D)偽彩圖； E～H.分別為造模第21天時ADC(E)、D(F)、D*(G)、f(H)偽彩圖； I～L.分別為造模第28天時ADC(I)、D(J)、D*(K)、f(L)偽彩圖

時間ADC(×10-4 mm2/s)D(×10-4 mm2/s)D*(×10-3 mm2/s)fHIF-1α評分第14天3.07±1.354.41±1.094.90±1.310.38±0.081.38±2.09第21天4.28±1.13*8.08±0.87*3.07±1.00*0.49±0.07*5.94±3.73*第28天4.60±1.11*8.27±1.10*4.80±1.52#0.26±0.09*#4.00±2.00*#F值6.7271.5910.0835.6211.28P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

注：*：與第14天比較，P<0.05；#：與第21天比較，P<0.05

圖2 SD大鼠C6腦膠質瘤模型腫瘤組織HIF-1α免疫組織化學染色圖(×100) 細胞質內出現棕色顆粒為HIF-1α陽性細胞，造模第14天(A)陽性細胞較第21天(B)及28天(C)減少，第28天(C)陽性細胞較第21天減少

以細胞質內出現棕色顆粒狀物判定為HIF-1α染色陽性。低倍鏡(×100)下觀察切片，隨機選擇5個HIF-1α陽性細胞密集區，高倍鏡(×200)下對密集區內陽性細胞進行計數，每個視野計數100個細胞(排除非特異性染色細胞)。根據視野內HIF-1α陽性細胞占所有細胞的百分比及陽性細胞染色程度對免疫組化結果進行評分：無HIF-1α陽性細胞為0分，HIF-1α陽性細胞占所有細胞的百分比<10%為1分、10%～50%為2分、>50%～75%為3分、>75%為4分；細胞質無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以2項評分的乘積作為HIF-1α評分結果。

1.6 統計學分析 采用SPSS 16.0統計分析軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示。采用單因素方差分析比較各時間點間IVIM-DWI參數及HIF-1α評分的差異，2時間點間比較采用SNK-q檢驗。以Pearson相關分析觀察各時間點IVIM-DWI參數與HIF-1α評分的相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

常規MRI：造模第14天腫瘤組織呈T1WI低信號、T2WI稍高信號；造模第21天腫瘤組織較造模第14天稍增大，呈T1WI低信號、T2WI稍高信號；造模第28天腫瘤內見壞死區，壞死區呈T1WI低信號、T2WI高信號。HE染色：造模第14天腫瘤細胞分布密集；第21、28天見部分腫瘤細胞壞死，壞死區細胞數減少、細胞核裂解，且第28天壞死區面積較第21天增大。

2.1 各時間點IVIM-DWI參數及HIF-1α評分比較 造模第14、21及28天，IVIM-DWI各參數及HIF-1α評分比較差異均有統計學意義(P均<0.01)。與造模第14天比較，造模第21天ADC、D、f及HIF-1α評分均升高，D*降低；造模第28天ADC值、D及HIF-1α評分均升高，f降低；差異均有統計學意義(P均<0.05)。與造模第21天比較，造模第28天D*升高、f及HIF-1α評分均降低(P均<0.05)。見表1。

2.2 IVIM-DWI參數與HIF-1α評分的相關性 造模第14天IVIM-DWI各參數與HIF-1α評分均無明顯相關性(P均>0.05)；造模第21天D、D*、f與HIF-1α評分均呈負相關(r=-0.73、-0.58、-0.67，P均<0.05)；造模第28天D、f與HIF-1α評分均呈負相關(r=-0.60、-0.65，P均<0.05)；造模第21及28天HIF-1α評分與ADC均無明顯相關性(P均>0.05)。

3 討論

膠質瘤通過刺激新生血管生成以保證氧氣及其他營養成分的供應，但新生血管內皮細胞功能不全，當腫瘤細胞氧消耗大于氧供應，且營養成分如糖類等供給不能滿足細胞增殖所需時，造成腫瘤微環境乏氧，腫瘤組織內出現乏氧區；乏氧嚴重導致細胞壞死、細胞核裂解，并逐漸發展為壞死區[7-8]。膠質瘤組織出現乏氧壞死區是導致其耐藥、預后不良的原因之一。目前臨床主要通過檢測氧分壓評估膠質瘤微環境的乏氧狀態及程度，但該檢查有創，患者接受度低；PET等影像學方法亦可用于評估膠質瘤微環境的乏氧狀態及程度，但具有輻射。

IVIM-DWI以多b值獲取系列DWI圖像，根據雙指數模型擬合，獲得組織擴散系數和微毛細血管灌注信息[9]。低b值掃描獲得的DWI反映組織內血流灌注及水分子擴散，且以對前者的反映為著；高b值掃描圖像僅反映組織水分子擴散；故采用多b值掃描的IVIM-DWI可將腫瘤組織血流灌注和水分子擴散分開，且無創、無需使用對比劑[10]。有研究[11-12]發現，IVIM-DWI可用于指導膠質瘤術前病理分期、鑒別高級別膠質瘤和轉移瘤等。本研究擬采用IVIM-DWI評估SD大鼠C6腦膠質瘤模型腫瘤微環境乏氧狀態。

既往研究[13]報道，氧敏感轉錄因子HIF-1α可感知腫瘤細胞氧及葡萄糖缺乏，表現為HIF-1α在腫瘤組織鄰近壞死區周圍的乏氧區高表達。本研究免疫組織化學化染色結果顯示，造模第14、21及28天HIF-1α評分比較差異均有統計學意義(P均<0.01)，且造模第21及28天HIF-1α評分均高于第14天，提示隨著膠質瘤的進展，腫瘤微環境出現乏氧；但造模第28天HIF-1α評分較第21天降低，可能原因為造模第21、28天腫瘤內出現壞死區，且第28天壞死區面積大于第21天，使乏氧區相對減小，HIF-1α表達降低。

IVIM-DWI結果顯示，造模第14、21及28天IVIM-DWI各參數比較差異均有統計學意義(P均<0.01)，且造模第21天D、D*、f與HIF-1α評分均呈負相關，造模第28天D、f與HIF-1α評分均呈負相關，提示IVIM-DWI可能反映腫瘤微環境的乏氧狀態。造模第28天ADC、D與第21天比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，可能原因為選取ROI時人為避開壞死區，使2個時間點ROI內腫瘤細胞密度相似，水分子擴散受限程度亦相似；造模第14天與第28天D*比較差異無統計學意義(P>0.05)，可能是造模第28天時腫瘤內乏氧區發展為壞死區，腫瘤組織內血流發生變化，導致檢測到的D*可能存在誤差。造模第21、28天時HIF-1α評分與D均呈負相關，可能原因為這2個時間點腫瘤乏氧區HIF-1α表達水平較高，且乏氧區腫瘤細胞數量多、排列密集，導致水分子擴散受限。造模第21、28天HIF-1α評分與f呈負相關，f與血流量及血容量有關，反映腫瘤組織的灌注情況，造模第21、28天腫瘤細胞增殖快，能量及營養缺乏，HIF-1α表達增加，但壞死區的出現使血液灌注相對下降，故HIF-1α評分與f呈負相關。造模第21天HIF-1α評分與D*呈負相關，而造模第28天二者無明顯相關性，可能原因為中樞神經系統的血流量相較于其他系統少，且D*易受腫瘤內細胞異質性及乏氧區血供等因素干擾，影響D*準確性[14]。造模第14天時IVIM各參數與HIF-1α評分均無明顯相關性，原因可能為造模第14天腫瘤體積較小，血液及糖類等營養供給尚可，尚未形成明顯乏氧及壞死區。造模第14、21及28天時HIF-1α評分與ADC均無明顯相關性，可能原因為膠質瘤細胞異型性和水分子擴散運動的復雜性，使ADC不能準確反映腫瘤細胞密度等特征。

綜上所述，IVIM-DWI能夠用于評價SD大鼠C6腦膠質瘤模型腫瘤微環境乏氧狀態。但隨著乏氧程度增加，壞死區逐漸增大，導致腫瘤組織血流發生變化、腫瘤細胞侵襲性增加等，影響IVIM-DWI參數的準確性；此外，本研究樣本量相對較少，且選取ROI時人為避開壞死區，動物模型受飼養環境等影響，HIF-1α免疫組織化學結果受染色環境、大鼠灌注效果等影響；故本研究尚需進一步完善。