基因編輯技術的發展及其在農業生產中的應用

何利娟，徐如夢，李冬月，鄭超，鄭二松，梁偉芳，周潔，楊勇，陳劍平，王栩鳴，嚴成其,3

1.浙江師范大學 生化學院，浙江 金華 321000；2.浙江省農業科學院，浙江省植物有害生物防控重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021；3.寧波市農業科學研究院，浙江 寧波 315040；4.云南農業大學，云南 昆明 650201；5.西北農林科技大學，陜西 楊凌712100

隨著系統生物學、分子生物學等學科的快速發展，全球農業科技正在發生顯著變化。大規模基因資源發掘和利用有了系統性的理論與堅實的分子生物學技術作為基礎。基因分析、細胞工程、染色體工程、分子標記輔助選擇、基因克隆與轉基因等技術已經成為高效種質創新的主體策略。分子設計育種將提供大量突破性品種并催生智能植物品種的誕生。傳統育種和基因工程相結合培育新的植物品系已經成為主流研究手段。其中，以CRISPR/Cas9 為代表的基因組編輯工具發展尤為迅猛，已成為一項新興的顛覆性技術。利用基因編輯改變作物產量、抗性等農業性狀方面的科研報道層出不窮。從純粹的技術手段上講，利用分子生物學操作改良作物，尤其像水稻這樣的模式生物的農藝性狀已經沒有不可逾越的技術障礙。然而，目前社會對轉基因應用的安全性還普遍存疑，世界各國對轉基因應用的管控也非常嚴格，而對基因編輯的監管也還有很多不甚明朗的地方。所以，從現實應用角度講，當前基因編輯技術在農業領域如何從一項研究轉化為可運用的技術，需要考慮更多的是社會的接受程度及相應產品的監管問題。

1 基因編輯

我們身處在一個遺傳學高速發展的時期，遺傳分析和遺傳操作技術進步飛速。高通量DNA測序和基因組編輯等技術正在通過模式生物研究、遺傳進化研究、食品工程改進、醫學應用等方面影響人們的生活。傳統的遺傳學研究依賴于自發突變的發現和分析，孟德爾（Gregor Johann Mendel）、摩爾根（Thomas Hunt Morgan）和埃弗里（Oswald Theodore Avery）等先驅很好地展示了這一點。在 20 世紀中葉，Muller 和 Auerbach 證明通過輻射或化學處理可以提高誘變率[1-2]。但這些操作，如輻射和化學誘變，在基因組中產生的是隨機變化的位點。20 世紀七、八十年代，在酵母和小鼠中產生了第一批靶向基因組變化[3-6]。從本質上來講，基因組編輯所做的就是打斷染色體DNA，而其關鍵在于這種打斷是特異性針對特定位點的。DNA 雙鏈斷裂（DSB）發生后，細胞會采用DNA 修復機制對斷裂點進行修復，修復過程中，目的基因會發生特定類型的突變或插入，從而實現基因編輯[7]。通常，修復機制導致非同源末端連接（NHEJ）和同源定向重組（HDR）2 種類型的修復。NHEJ 主要導致可變長度的插入和缺失突變，因此可用于敲除基因。HDR 通常依賴于未損傷的染色單體與同源序列的重組，HDR 基因打靶在高等真核生物細胞中不是一個有效的過程，通常只有大約1/100 萬的細胞經歷了所需的基因組修飾[8-9]。這種基因編輯有著非常大的潛力，但在目前技術條件下其非重組效率非常低，且還受其他相關技術的限制，因而其應用范圍還比較有限[9]。

鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶（transcription acti?vator-like effector nuclease，TALEN）這 2 種DNA 結合蛋白也可以被工程化以編輯特定目的基因。ZFN 由鋅指DNA 結合域與DNA 切割域融合而成，其編輯效率取決于核酸酶的DNA 親和力和特異性。ZFN 技術已用于多種動植物的基因編輯，且在醫學領域也顯示出重大價值，用于多種病毒的編輯，是一種有效的抗病毒藥物[10]。TALEN 源于人們對轉錄激活因子樣效應因子（transcription activator-like effector，TALE）的認識。最初在植物病原體黃單胞菌中發現TALE 能通過細菌Ⅲ型分泌系統被注入植物細胞，通過靶定效應因子促進細菌的侵染。基于其序列特異性結合能力，人們通過將其與FokⅠ核酸酶連接，創造了基因組編輯工具TALEN[11]。ZFN 和TALEN 技術都需要合成能夠與特異DNA 序列結合的蛋白模塊，這一步驟非常繁瑣費時。CRISPR/Cas 技術則使用一段向導RNA 引導核酸內切酶到靶點處完成基因組編輯。與ZFN 和TALEN 技術相比，基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術更加簡單靈活，基本適應所有類型的細胞和生物體[12-13]。

1.1 ZFN技術

早期基于鋅指核酸酶等方法的基因編輯技術又被稱為基因打靶。ZFN 具有單獨的DNA 結合結構域和DNA 切割結構域，即天然型IIS 限制酶FokⅠ具有物理上可分割的特性[14]。Kim 等的研究表明，可以通過用人工識別結構域替代天然識別結構域重定向切割位點[15-16]。ZFN的功能首先是在體外被證明的，作為嵌合型限制性內切核酸酶，其顯示出明確的切割活性[17]。在非洲爪蟾卵母細胞中用合成的ZFN 進行的實驗顯示出非常高的切割和重組效率[18]。Bibikova 等此后又在果蠅中實現了靶向誘變和靶向基因置換[19-20]。在后繼研究中，ZFN 又被運用到青蛙、大鼠、小鼠、水芹、煙草等各種生物的基因編輯中[4,21-26]。雖然在不同物種中基因編輯效率有所不同，但普遍在10%左右。值得一提的是，在針對植物的基因編輯實驗中，相關技術手段更為多樣化。有一些編輯是通過農桿菌介導轉化，并利用病毒啟動子控制相關編碼序列來實現的[27-29]，也有采用直接DNA 轉化[28,30-32]或者利用病毒作為載體的成功案例[24]。雖然大量報道證實了ZFN的靶向誘變效果，但在某些物種或細胞類型中卻沒有發現基因替換。例如在斑馬魚中，雖然ZFN的誘變效率明顯很高，但未見有利用ZFN 實現基因同源替換的報道。采用共注射作為DNA 供體技術在實驗中未發現問題，但該技術似乎無法實現靶位點的切割和重組。這些情況表明，DSB 修復機制在不同的細胞類型和發育階段是不同的。ZFN 技術在大量物種中證明可行，其基因編輯效率也可以接受，但是其構建策略復雜，構建過程動輒需要2～3個月，后期篩選成本也比較大。

1.2 TALEN技術

由于基于ZFN的技術具有許多不足，且構建過程復雜，應用成本高，還存在較高的“脫靶”概率，因此，人們在不斷積極探索新的基因組編輯方法。TALEN 就是其中的一種[33]。TALEN 系統的發展歷史與黃單胞菌屬細菌的研究有關。這些細菌是水稻、胡椒和番茄等作物的病原體，研究顯示這些病原物會將TALE 分泌到植物細胞的細胞質中，從而影響植物的代謝過程，使其對病原物變得更加易感。

對TALE的進一步研究表明，它們能夠通過模仿真核轉錄因子與DNA 結合并激活其靶基因的表達。TALE 由DNA 結合結構域、核定位信號和激活結構域組成[34]。早在2007，這些蛋白質與DNA 結合能力就已有報道[35]，之后2 組研究人員分別破譯了TALE 蛋白識別靶DNA的代碼[36-37]。證明DNA 結合結構域由單體組成，其中每一個單體結合一個核苷酸。單體由34 個氨基酸殘基的串聯重復序列構成，其中第12 和13 位是高度可變的（repeat variable diresidue，RVD），它們負責識別特定的核苷酸。TALE 簡單的識別特性受到研究者的注意[38]。理論上，人工合成的TALEN 能夠識別任何已知的基因組區域，進而引入雙鏈斷裂。惟一限制是靶序列的5'端之前需要堿基T。但這一缺點影響并不大，因為在大多數情況下，可以通過改變間隔序列長度來保證這一點。一旦進入細胞核，TALEN 就會與靶位點結合，而蛋白C 端的FokⅠ結構則會工作引入雙鏈斷裂，并最終實現基因編輯的目的[39]。

1.3 CRISPR/Cas9技術

在TALEN 技術問世后約2年，另一種基于CRISPR/Cas的基因組編輯系統被開發出來，其主要元件是非編碼RNA 和Cas 蛋白。與嵌合TALEN蛋白不同，CRISPR/Cas 系統通過非編碼RNA 識別靶位點，利用RNA 和DNA 之間互作來進行靶基因的錨定，形成的非編碼RNA 和Cas 蛋白的復合物則會切割相應的基因位點。早在1987年，就在某些細菌基因中發現了一些奇特的重復序列[40]，而在接下來的近20年里，它們的功能一直未被弄清。直到2005年，細菌基因組測序才逐漸揭開了這些序列的神秘面紗。相關研究顯示，許多微生物的基因組中都存在相似的核苷酸序列，即一些通過短回文重復序列分開的DNA 區域，被命名為規律成簇的間隔短回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。這些CRISPR 表達盒往往位于具有解旋酶和核酸酶活性的 Cas 基因附近[41]。2005年，3 個獨立的生物信息學研究小組報告，CRISPR 表達盒中間區DNA 通常與許多噬菌體和質粒的DNA 同源[42-44]。2007年，在嗜熱鏈球菌中的研究表明，細胞如果在CRISPR 基因座上攜帶與噬菌體基因組DNA 互補片段，會使其對噬菌體具有抗性[45]。

CRISPR 系統起源古老，在原核生物中廣泛存在，87%的古細菌和48%的真細菌中都有它們的身影[46]。由于這個原因，CRISPR 系統在不同物種中顯示出相當高的保守性。在大多數物種中，CRISPR 盒數量（1～18）、重復大小（23～37 bp）及間隔物的數量和大小（17～84 bp）都相當類似[47]。

自然界中，CRISPR 系統的保護機制形成分為3 個主要階段。第一階段，將進入宿主細胞的外源DNA 小片段插入宿主基因組的CRISPR 基因座，形成新的間隔區，間隔區側翼有2～5 bp的保守序列 PAM（protospacer adjacent motif）[48-49]。新形成的間隔區總是插入CRISPR 表達盒前導序列之前富含AT的一頭。這也是大多數CRISPR/Cas系統新靶標形成的方式[50-51]。第二階段，是整個CRISPR 基因座的轉錄。基因座被轉錄為長的pre-crRNA（poly-spacer 前體 crRNA）。在大多數CRISPR/Cas 系統中，未成熟轉錄物加工為成熟crRNA（CRISPR RNA）是通過Cas6 內切核酸酶實現的[52-54]。crRNA 通常為 39～45 個核苷酸，其中含有一個間隔序列，而它們的末端則含有參與莖環結構形成的序列[55-56]。第三階段，參與外源DNA或RNA的干擾。由crRNA 和Cas 蛋白復合物來實現，crRNA 負責互補識別靶標序列，Cas 蛋白則負責對其進行切割降解。

另一方面，病原物在與其宿主的長期協同進化過程中形成了針對CRISPR 干擾的保護機制[57]，因而在細菌和古細菌中存在多種CRISPR/Cas 系統。生物信息學研究顯示，CRISPR/Cas 系統可分為3 種大類型和至少10 種亞型[41,47]。其中，從化膿性鏈球菌病原體分離的II-A CRISPR/Cas 系統使用最廣泛。從這種細菌中發現了一組最小的Cas 基因，以及一種多功能的Cas9 蛋白。該蛋白既能對pre-crRNA 進行加工，也能對外源DNA 進行切割[47,58]。crRNA 加工還依賴于小的非編碼RNA——tra-crRNA（trans-activating crRNA）。tracrRNA 分子與pre-crRNA 中的重復序列互補結合，形成雙鏈體，然后在宿主細胞的RNaseⅢ與Cas9 復合體共同作用下切割雙鏈體，形成含有20個核苷酸間隔序列的成熟crRNA。在Mg2+存在的情況下，Cas9 在crRNA的引導下，在靶基因座中產生雙鏈斷裂[59]。在實際應用中，我們還需要考慮CRISPR/Cas 系統的PAM 序列，常用的化膿性鏈球菌Cas9的靶DNA 必須含有序列為NGG的PAM，而在嗜熱鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌中，Ⅱ型Cas9 對應的PAM 序列則分別為NGGNG 和NNNNGATT[59-60]。

2 基因編輯的應用

2.1 基因編輯在醫療領域的應用

基因組編輯已成為科研和商業、醫學應用中廣泛使用的工具，CRISPR/Cas 無可否認是其中最為便捷且應用最為廣泛的一項技術。由于先前使用ZFN 和TALEN的研究取得了令人鼓舞的結果[61-62]，一些涉及基因組編輯的體細胞療法已獲準用于Ⅰ期臨床試驗[63-64]。相較于體細胞級別的治療，種系編輯要更為激進，因為它能夠將編輯傳遞至胚胎，導致疾病的基因位點永遠地從被治療的個體的血統中消失。但這樣做的風險也非常大，因為糾正DNA 序列的嘗試有可能是弊大于利的。而且，由于基因組中的突變不僅影響受治療的個體，還會遺傳給其后代，因而它們的效果還存在很大的不可預測性。由于CRISPR的編輯的易用性，基于該技術的種系編輯存在被濫用的可能，帶來的一系列倫理問題也值得人們深思[65]。

2.2 基因驅動與基因編輯

基因驅動是一種基于基因編輯的基因工程技術。與普通的基因編輯相比，它能夠快速地在整個種群中傳播經過修改的基因。自然界也存在天然基因驅動，但目前研究者的興趣主要集中在由CRISPR/Cas9 介導的基因驅動[66]。蚊子是很多熱帶疾病的載體，傳播的疾病對人類生命和健康造成了威脅。目前已有針對蚊子開展利用基因驅動的研究，生產雌性不育的蚊子[67]或使蚊子群體無法傳播瘧疾[68]。基因驅動的好處比較直接：在公共衛生方面，可利用這種技術制造遏制登革熱、瘧疾和寨卡病毒傳播的轉基因蚊子；在農業方面，可通過該技術控制或修改那些破壞作物或攜帶作物疾病的物種。但是它對生態方面的影響卻是非常深遠的，即便是來自實驗室的一次很小的、事故性的釋放都有可能造成基因驅動的全球傳播。此外，基因驅動技術還有可能帶來意想不到的后果，比如對非目標物種造成破壞或制造出新的強勢入侵物種。

2.3 基因編輯在農業方面的應用

CRISPR/Cas9 是目前獲得廣泛認可的專一性好、基因定點突變效率高的基因組編輯技術。作為新的基因定點編輯工具，其構建簡單、成本低、快速且高效，已廣泛用于牲畜和農作物的基因組編輯。從本質上講，由基因編輯所產生的新品種都是經過基因改造的，屬于廣義的轉基因范疇。但它們與早期的轉基因生物又有重大區別[69]。大多數情況下，這些新品種沒有引入來自其他物種的遺傳物質，而且引入的變化通常在自然情況下也會發生。即使是利用基因編輯導入外源DNA，它們也是被精確地插入基因組的特定位置。因此，相比傳統的轉基因技術，其安全性高得多。

目前基因編輯作物的例子非常的多，包括高產水稻[70]、抗病小麥[71]、耐儲存的馬鈴薯[72]和生產健康油料的大豆[73]等。畜牧產品方面也有很多成功案例，如缺乏角的奶牛[74]、綿羊[75-76]、攜帶更多肌肉的豬和其他食用動物[77]。基因組編輯具有優于育種選擇的優勢，即可以在一代中引入性狀而不破壞有利的遺傳背景。可以將相同的有益修飾引入適合于不同環境的不同品種或栽培品種。2016年，Nature雜志在報道中提到美國賓夕法尼亞州立大學科學家楊亦農利用CRISPR/Cas9基因編輯技術得到的工程化蘑菇已經開始種植售賣，而美國農業部并沒有對這種新型CRISPR/Cas9 基因編輯蘑菇進行管制。美國農業部認為不需特殊監管程序來監管這種蘑菇的培養和售賣。此外，還有幾十種基因修飾生物（genetically modified organisms，GMO）（大多數是植物）也被美國農業部認可無需特殊監管[78]。這些通過編輯進行精確基因組修飾的產品是否會比早期的轉基因生物更易獲得公眾認可，還有待觀察。

2.4 CRISPR/Cas9技術在水稻育種中的應用前景

全球有超過30 億人每天攝取大米，水稻所提供的能量約占世界膳食消耗總能量的20%[79]。由于水稻具有廣泛的適應性，因此，它的生產是事關全球糧食安全的戰略性議題[80]。隨著基因編輯技術的快速發展，CRISPR/Cas9 技術在水稻基因功能研究方面有了長足發展。采用CRISPR/Cas9技術編輯水稻基因組，改變水稻的各種農藝性狀，已不再具有不可逾越的技術障礙。過去的幾十年中，傳統的突變體篩選和分子輔助育種為水稻生產做出了巨大貢獻。然而目前，水稻生產面臨諸多新挑戰，如人口快速增長、全球氣候變化，以及由此衍生的新的病蟲害及其他環境問題。因此，迫切需要更先進的技術和方法來創制水稻新品種，使其具有更高的產量、更好的生物/非生物脅迫耐受性。

從2013年起，有大量關于CRISPR/Cas9 系統在水稻中成功定向誘變的報道[81-85]。其中部分研究還顯示，相比于TALEN，CRISPR/Cas9 系統誘發的突變頻率更高[84]。在作物中，產量、質量和脅迫響應等農藝學性狀往往由多個基因共同控制，因此有不少探究水稻多靶點基因編輯方法及效率的研究。實際結果非常鼓舞人心，基于CRISPR/Cas9 構建的三靶點、四靶點的基因編輯都獲得了成功[81,86-87]。這些研究清楚地表明CRISPR/Cas9 系統是水稻染色體工程的高效工具。Ma 等的一項研究還測試了基因組編輯效率[88]，在水稻基因組中編輯的46 個目標位點平均突變頻率為85.4%。該研究還同時編輯了OsWaxy 基因內的3 個位點，使編輯后的材料直鏈淀粉含量降低了14%。此后，Liang 等開發了水稻 CRISPR/Cas9-sgRNA 多重編輯系統新策略，設計了21 個sgRNA，其中82%的目標位點顯示缺失、插入、取代和倒位，顯示出CRISPR/Cas9 優秀的編輯效率[89]。所有這些研究表明，CRISPR/Cas9 系統能夠高效地產生單個或多個基因突變，可用于加速水稻育種。

CRISPR/Cas9 技術為水稻從基礎研究到生產應用的銜接提供了橋梁，能為水稻育種實踐提供更直接的助力，有著極其廣闊的應用前景。更重要的是，CRISPR/Cas9 技術在水稻中的應用具有很強的實用性，比如針對水稻抗病性的研究和產量方面的研究。水稻對東格魯病的抗性與翻譯起始因子4γ基因（eIF4G）密切相關，利用CRISPR/Cas9 產生突變后，敏感品種IR64 也能獲得對東格魯病的抗性，從而提高水稻產量[90]。研究顯示，采用 CRISPR/Cas9 系統同時對 Grain Width2（GS3）、Grain Width（GW5）和 Grain Width（TGW6）進行編輯，能夠顯著增加谷粒重量[91]。朱健康院士團隊利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術編輯ABA 受體基因，提高了水稻產量[70]。

3 基因編輯的優勢及面臨的問題

常規轉基因技術普遍采用的方式是通過導入外源基因來實現相關性狀的改良。這種操作會向作物基因組導入3 類外源物質：一是目標外源基因，二是用于調控目標基因表達的相關元件，三是轉基因篩選標簽[92]。其中，外源基因又可以從親緣關系上分為多種情況。例如，向水稻導入不同品種的基因、導入同族的野生稻基因、導入其他物種基因等。而表達調控元件和轉基因篩選標簽更是五花八門，各種各樣。正是由于這種紛繁復雜的情況，導致了轉基因產品管理的復雜性，也使得社會和科學共同體內部對轉基因應用的安全性存有揮之不去的疑慮。這些擔心也是很好理解的，因為任何一部分外源物質導致的不可預知的后果，都會影響到轉基因產品整體的安全性。這些擔憂也是農業轉基因生物技術應用的主要阻力之一。

以CRISPR/Cas9 為代表的基因編輯技術與傳統的轉基因技術有著很大的差別。從本質上來講，它們的生物學功能是切割降解DNA，因此，CRISPR/Cas9 基因編輯技術非常適合于對特定目標基因的特定位點進行剪切，造成單核苷酸級別的改變，從而改變作物的原有基因功能。當然，CRISPR/Cas9 或其他方法介導的雙鏈斷裂后的DNA 修復過程都取決于細胞的修復機制。NHEJ在連接斷裂DNA 時會引入一些突變，而大多情況下高等真核生物NHEJ 產生突變，而非插入DNA片段。因此，如果目標僅僅是敲除蛋白質編碼序列，這樣的編輯效率是比較高的。當然這一技術也能用于外源DNA 片段導入，只是效率較低，成本較高[93-94]。值得一提的是，對于非插入型的應用，在基因編輯完成后，可以從分離的后代中找到完全沒有任何外源片段的材料，這也是大家追求的結果。就目前的報道來看，包括CRISPR/Cas系統和ZFN、TALEN 在內的基因編輯方法的有效性都很好，但它們的特異性都不完美，均存在脫靶問題，而且有潛在的產生一系列脫靶效應的可能，引起基因組的重排或無法預測的突變，甚至會導致細胞死亡[95]。人們對脫靶的關注程度取決于應用。在醫學應用上這個問題相對嚴重，因為脫靶導致的無法預測的結果有時是無法接受的。當然如果脫靶不會引發新的臨床病癥的突變，它們并非不可忍受。在農業應用，尤其是作物基因編輯方面，由于不涉及倫理問題，這一缺點就不是非常明顯。因為研究者可以對作物的基因組進行完整測序，并且可以徹底分析突變材料的表型，從而排除那些無效或有害的突變。

4 結語

隨著CRISPR/Cas9 基因編輯技術的飛速發展，人們變得越來越關注這一技術的倫理和社會影響。在醫學領域，如何限定基因編輯技術的應用顯得非常令人困惑。當然，針對某些破壞性疾病，如亨廷頓病和肌肉萎縮癥，顯然社會比較容易形成共識；但如果是身材矮小、運動能力低下這些問題，則回答就會模糊得多。更進一步，頭發顏色、眼睛顏色、身高、膚色，這些方面是否允許做人為改變，則涉及更深層次的倫理問題，一定會引起更廣泛的爭論。所幸的是在農業應用方面這些問題不那么尖銳，因為農業產品尤其是作物往往很少涉及倫理問題。但監管方面的爭論依然十分激烈。目前歐盟對轉基因和基因編輯的監管在全球來講相對比較嚴格，其法律要求任何基因改造的作物都必須是可檢測的，且遺傳變化必須與傳統育種技術具有相同的穩定性。但歐盟內反對轉基因群體的呼聲一直也很高，這些群體認為轉基因技術有可能產生“非自然”的危害，因為它們不是生物體的“正常”部分，基因編輯同傳統的轉基因一樣應該受到嚴格監管。但是像CRISPR/Cas9 這樣的新技術又顯得非常不同，因為所有的基因編輯變化雖然都是可檢測的，但這些改變與其他傳統的育種方法，如輻照誘變、化學誘變引入的變化無法區分。因此，在爭論還在繼續的情形下，政府與國家層面的規范和立法對該技術未來的發展至關重要。