重組新城疫病毒疫苗研制現狀

李文桂，陳雅棠

重慶醫科大學附屬第一醫院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）又稱禽副粘病毒1 型（Avian paramyxovirus type 1，APMV-1），是禽類新城疫的病原體，對禽類養殖危害較大。按照其致病特性，NDV 常分為低毒、中毒和高度株，其中低毒株是傳遞目的基因的理想載體，可作為病毒載體表達外源基因。Peeters等[1-2]首先構建了NDV的反向遺傳操作系統，這為構建重組新城疫病毒提供了有利工具。人們先后構建了多種表達綠色熒光蛋白（GFP）或增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的重組 NDV 疫苗[3-5]，這為篩選重組新城疫病毒提供了方便。國內外學者先后報道了大量重組新城疫病毒疫苗，這些病原體包括禽流感病毒、人副流感病毒3 型、犬瘟熱病毒、禽巨肺病毒、呼吸道合胞病毒、Nipah 病毒、水皰性口炎病毒、狂犬病毒、牛短嶄熱病毒、傳染性支氣管炎病毒、重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、腸病毒71 型、脊灰病毒、Ⅰ型人類免疫缺陷病毒、傳染性法氏囊病毒、諾如病毒、非洲豬瘟病毒、牛皰疹病毒1 型、西尼羅病毒、鵝細小病毒、豬圓環病毒Ⅱ型、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體和博氏疏螺旋體等。在此，我們簡要綜述重組新城疫病毒的構建及其免疫機制等方面的研究進展。

1 重組新城疫病毒抗正粘病毒

1.1 禽流感病毒

禽流感病毒（Avian influence virus，AIV）的血清型多，變異性強，嚴重威脅養禽業，并可感染人類。AIV 可分為低致病（LPAIV）的 H9N2 型和高致病（HPAIV）的H5N1 和H7N9 型。血凝素（HA）是一種包膜糖蛋白，可誘導宿主產生細胞和體液免疫應答[6]。Nakaya 等[7]將 HA 基因插入 pNDV/B1得 pNDV-HA，加輔助質粒 pTM-NP、pTM-N 和pTM-L 共同導入新城疫病毒HB1 株，然后轉染雞胚成纖維細胞（CEF）的DF1 株，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-HA表達的70kD的HA抗原。將 3×107PFU 疫苗靜脈或腹腔注射BALB/c 鼠，初次接種后4 周進行加強，初次接種后5 周免疫組的血清IgG 上升，滴度分別為 1∶360 和 1∶110，此時用 105PFU的 A 型流感病毒WSN-33 株進行滴鼻攻擊，攻擊后10 d 發現靜脈、腹腔注射組和對照組的保護力分別為100%（5/5)、100%（5/5）和0（0/5）。

Nagy 等[8]將 HA 基因插入 pNDV 得 pNDV-HA，加新城疫病毒LaSota 株轉染人腺癌肺泡基底上皮細胞A549，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可識別 rNDV-HA 表達的63kD的HA抗原；將 107病灶形成單位（FFU）疫苗點眼滴鼻或肌肉注射接種2 周齡仔雞，接種后4 周提示免疫組血清IgG 上升，此時用107PFU 禽流感病毒H9N2 株進行點眼滴鼻攻擊，攻擊后3～9 d 發現口咽和泄殖腔拭子的病毒負荷明顯降低，肝、肺和支氣管病變顯著減輕。Hu 等[9]將HA 基因插入pLX 得pLX-HA，加新城疫病毒LaSota株共同轉染BSR-T7/5 株，篩選重組病毒，以從rNDVHA 提取的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1750 bp的基因片端；將5×106EID50（雞胚半數感染量）疫苗滴鼻接種3 周齡仔雞，初次接種后2 周進行加強，初次接種后4 周提示免疫組血清IgG 上升，此時用105EID50禽流感病毒H7N9 株進行滴鼻攻擊，攻擊后2 周免疫組和對照組的存活率分別為80%（8/10）和0（0/5）。曹有才等[10]將HA 基因插入pBSK得pBS-HA，與pBRN-FL 重組得pBRN-HA，加新城疫病毒LaSota 株共同轉染BSR-7 細胞，篩選重組病毒，間接免疫熒光技術提示rNDV-HA的表面含有HA 抗原分子。胡瀟等[11]將HA 基因插入pMD-18T得pMD-HA，與pTS-M 重組得pTS-HA，加新城疫病毒 LaSota 株轉染 BHK-21 細胞，Western 印跡發現感染血清可識別rNDV-HA 表達的61 kD的HA 抗原。

人們發現將目的基因按照動物密碼子的使用偏好進行優化，可明顯提高靶基因在細胞中的表達水平，從而增強DNA 疫苗的免疫原性。陳曦等[12]將密碼子優化的HA 序列（OptHA）插入pBSK得 pBSK-OptHA，與 pBRN-FL 重組得 pBRN-Op?tHA，加新城疫病毒LaSota 株共同轉染BHK-21 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合 rNDV-OptHA 表達的 55 kD的 OptHA 抗原，共聚焦顯微鏡顯示rNDV-OptHA 感染的細胞中存在HA 和NDV 抗原，其中表達的HA 蛋白定位于細胞膜上；將5×106EID50疫苗點眼滴鼻免疫1 周齡仔雞，初次接種后5 周進行加強，提示免疫組的血清IgG 在初次接種后2～8 周上升，初次接種后7周上升到較高程度。

1.2 人副流感病毒3型

人副流感病毒3型（Human parainfluenza vi?rus type 3，HPIV3）是呼吸道感染的常見病原體。HN 蛋白位于病毒棘突的表面，具有血凝素和神經氨酸酶的活性，是一種保護性抗原[13]。Bukreyev等[14]將 HN 基因插入 pNDV 得 pNDV-HN，轉化新城疫病毒BC 株后再轉染人表皮樣瘤癌細胞Hep-2，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合 rNDV-HN表達的65kD的HN抗原；將 106.5PFU疫苗滴鼻加支氣管注射接種非洲綠猴，初次接種后后4 周進行加強，提示免疫組血清IgG 在初次接種后4～8 周上升，初次接種后8 周上升到較高程度，滴度可達1∶12.3。

2 重組新城疫病毒病毒抗副粘病毒

2.1 犬瘟熱病毒

犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）是犬瘟熱的病原體。H 基因編碼的糖蛋白H 在病毒融合、生長和細胞嗜性方面具有重要作用，Cher?pillod 等[15]將pCI-H/F 肌肉注射免疫犬可有效對抗CDV的攻擊,提示H/F 蛋白具有較好的免疫原性。田美杰等[16]以犬瘟熱病毒的總RNA 為模板擴增 2330 bp的H基因，插入 pBSK 得 pBS-H，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-H 表達的85kD的H蛋白；將2×109.5EID50疫苗肌肉注射接種犬，初次接種后3 周進行加強，提示免疫組血清IgG 在初次接種后2～5 周上升，初次接種后4 周上升到較高程度，滴度為1∶64。Ge 等[17]以犬瘟熱病毒的總RNA 為模板擴增H 和F基因片段，分別插入pLaSota 得pLa-H/F，加輔助質粒轉染Hep-2 細胞，篩選重組蛋白，以從rNDVH/F 抽提的總 RNA 為模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出相應的H 基因和F 基因片段；將1×109EID50疫苗肌肉注射接種6 周齡水貂，初次接種后3 周進行加強，初次接種后5 周提示免疫組血清中和抗體上升，此時用2×104TCID50（半數組織培養感染劑量）犬瘟熱病毒TM/JL2008 株進行滴鼻攻擊，攻擊后3 周rCDV-H、rCDV-F 和對照組的存活率分別為100%（4/4）、75%（3/4）和50%（2/4）。

2.2 禽巨肺病毒

禽巨肺病毒（Avian metapmeumovirus，AMPV）是火雞鼻支氣管炎的病原體之一。糖蛋白GP 和融合蛋白F 是2 種主要的膜系結構蛋白，具有較好的免疫原性[18]。Hu 等[19]以禽巨肺病毒的總RNA 為模板擴增G/F 基因，將G 基因插入pFLC-pLaSota 株得pLa-G，加輔助質粒轉染DF1 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-F 抽提的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的G 基因片段；將107TCID50疫苗點眼滴鼻接種1 周齡火雞，初次接種后2 周進行加強，初次接種后4 周提示免疫組血清 IgG 上升，此時用 4.2×1010TCID50禽巨肺病毒CoTr 株進行點眼滴鼻攻擊，攻擊后1 周取支氣管拭子，熒光定量PCR 檢查病毒負荷，發現免疫組和對照組的保護力分別為20%（2/10）和0（0/10）；隨后將 F 基因插 入 pIRES-hrGFR2α 得pIRES-F，與 pLa-G 重組得 pLa-G/F，加輔助質粒轉染DF1 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-G/F 抽提的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的 G 基因片段和 1700 bp的 F 基因片段；將107TCID50疫苗點眼滴鼻接種1 d 齡火雞，接種后4 周提示免疫組血清IgG 上升，此時用1×103ID50（半數感染劑量）禽巨肺病毒AMPV-C 株進行點眼滴鼻攻擊，攻擊后1 周免疫組和對照組的保護力分別為80%（8/10）和0（0/10）。

2.3 呼吸道合胞病毒

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）可引起小兒毛細支氣管炎或支氣管肺炎。融合蛋白F 是一種包膜蛋白，可引起RSV 與宿主細胞膜的融合，誘導宿主產生一定的保護力[20]。Martinez-Sobrido 等[21]將 F 基因插入 pLaSota 得 pLa-F，加輔助質粒轉化Vero 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-F 提取的總RNA 為模板，采用RT-PCR方法可克隆出F 基因片段；將5×105PFU 疫苗滴鼻接種IFNAR-/-鼠，接種后4 周用107PFU 呼吸道合胞病毒有毒株進行鼻滴攻擊，攻擊后8 d 提示免疫組肺組織的病毒負荷下降至1/10，肺組織的病變減輕，ELISPOT 證實脾 IFN-γ+SFCs 數目增加。

2.4 Nipah病毒

Nipah 病毒（Nipah virus，NiV）可引起呼吸道感染，重癥常伴有病毒性腦炎等并發癥。糖蛋白G 和融合蛋白F 是Nipah 病毒包膜蛋白的主要成分，將它們免疫仔豬可產生有效的抵抗力[22]。Kong 等[23]將G/F 基因插入pLaSota 得pLa-G/F，加輔助質粒轉化BHK-21 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-G/F 抽提的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出1920 bp的 G 基因片段和 1700 bp的 F 基因片段；將 2×109EID50疫苗肌肉注射接種仔豬，初次接種后4 周加強1 次，免疫組血清 IgG 在初次接種后 2～29 周上升，初次接種后13 周上升到較高程度。

3 重組新城疫病毒抗彈狀病毒

3.1 水皰性口炎病毒

水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）是水皰性口炎的病原，將糖蛋白GP 免疫宿主可產生較好的免疫應答[24]。李曉芳等[25]以水皰性口炎病毒的基因組DNA 為模板擴增1592 bp的GP 基因，插入 pBSK 得 pBS-GP，與 pBRN-FL 重組得 pBRN-GP，加輔助質粒轉染BHK-21 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-GP 表達的60 kD的 GP 抗原；將 2×106EID50疫苗肌肉注射接種BALB/c 鼠，初次接種后3 周進行加強，提示免疫組血清IgG 在初次接種后2～5 周上升，初次接種后5 周上升到較高程度。Zhang 等[26]將107TCID50疫苗肌肉注射接種BALB/c 鼠，初次接種后3 周進行加強，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG、IgG2a 和IgG1 上升；此時用107TCID50水皰性口炎病毒有毒株進行滴鼻攻擊，攻擊后5 d 免疫組的心腦肝腎組織病毒負荷下降至1/104；隨后將107TCID50疫苗接種BALB/c鼠，雌雄共養2 周后產下仔鼠，用103TCID50水皰性口炎病毒EP 株對12 d 齡的仔鼠進行滴鼻攻擊，攻擊后12 d 免疫組和對照組的存活率分別為33%（3/9）和0（0/9）。

3.2 狂犬病毒

狂犬病毒（Rabies virus）是狂犬病的病原體，用狂犬病毒糖蛋白RGP 免疫動物可產生較好的抵抗力[27]。Ge 等[28]以狂犬病毒的總RNA 為模板擴增 RGP 基因，插入 pLaSota 得 pLa-RGP，加輔助質粒轉染A549 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-RGP 表達的RGP 抗原。將108.3、107.3和106.3EID50疫苗分別肌肉注射或滴鼻接種BALB/c 鼠，接種后3 周提示免疫組血清IgG 上升，此時肌肉注射50 MID50（半數小鼠感染劑量）狂犬病毒GX/09 株進行攻擊，攻擊后12 d 108.3免疫組、107.3免疫組、106.3免疫組和對照組的存活率分別為 100%（10/10）、100%（10/10）、60%（6/10）和 0（0/10）；隨后將 109.8、109.3和 108.3EID50疫苗肌肉注射或滴鼻接種貓和犬，初次接種后3、6 周加強2 次，提示免疫組血清IgG 和中和抗體在初次接種后3～9 周上升，初次接種后60 周肌肉注射105.8MID50狂犬病毒GX/09 株進行攻擊，攻擊后12 周各免疫組的存活率均為100%（5/5），而對照組為20%（1/5）。

3.3 牛短嶄熱病毒

牛短嶄熱病毒（Bovine ephemeral fever virus，BEFV）是牛短嶄熱病的病原體之一。糖蛋白G 是一種包膜蛋白，可作為保護性抗原[29]。Zhang 等[30]以牛短嶄熱病毒的總RNA 為模板擴增G 基因，插入pLaSota 得pLa-G，加輔助質粒轉化MDBK 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合 rNDV-G 表達的 80 kD的 G 抗原；將 2×107TCID50疫苗肌肉注射Holstein 小牛，初次接種后3周進行加強，初次接種后5 周提示免疫組血清中和抗體升高，滴度為1∶32。

4 重組新城疫病毒抗冠狀病毒

4.1 傳染性支氣管炎病毒

傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis vi?rus，IBV）是雞傳染性支氣管炎的主要病原體。纖突蛋白S 是位于病毒粒子表層囊膜上的糖蛋白，可誘導機體產生中和抗體[31]。S 蛋白可分解為S1和S2 亞單位，S1 亞單位高度易變，有助于病毒黏附于宿主細胞，含有主要的中和表位；S2 亞單位高度保守，有助于病毒的融合活性。焦利紅等[32]以傳染性支氣管炎病毒M41 株DNA 為模板擴增S基因，插入 pBSK 得 pBS-S，與 pBRN-FL 重組得pBRN-S，加輔助質粒轉染BSK 細胞，篩選重組病毒蛋白，以從rNDV-S 提取的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出3534 bp的S 基因片段。Zhao 等[33]以傳染性支氣管炎病毒M41 株總RNA為模板擴增 S1 基因，插入 pNDV 得 pNDV-S1，加輔助質粒轉染BSR-T7/5 細胞，篩選重組病毒，以從 rNDV-S 抽提的總 RNA 為模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出S1 基因片段；將106EID50疫苗點眼滴鼻接種2 周齡仔雞，初次接種后2 周進行加強，初次接種后3 周提示免疫組血清IgG 上升，流氏細胞儀（FACS）證實外周血單核細胞（PBMC）中CD4+和CD8+T 細胞數增加，此時用106EID50傳染性支氣管炎病毒有毒株進行點眼滴鼻攻擊，攻擊后2 周免疫組和對照組的存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。

4.2 重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒

重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）是重癥急性呼吸綜合征的病原體，棘突蛋白S 是一種結構蛋白，在病毒與宿主細胞的融合過程中起關鍵作用，將其接種宿主可產生中和抗體[34]。Dinapoli 等[35]將 107PFU 重組 NDV-S 疫 苗皮下注射非洲綠猴，初次接種后4 周進行加強，提示免疫組血清IgG 和中和抗體、支氣管灌洗液和鼻咽拭子的SIgA 均在初次接種后28～56 d 上升，初次接種后42 d 上升到較高程度，初次接種后56 d 用106TCID50的SARS-CoV 進行滴鼻加氣管內注射攻擊，攻擊后2 d 免疫組肺組織的病毒負荷下降至1/10 000，肺組織的病變減輕。

5 重組新城疫病毒抗絲狀病毒

5.1 埃博拉病毒

埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）是人類重癥出血熱的病原體之一，用包膜糖蛋白GP 免疫宿主可產生較好的保護力[36]。Dinapoli 等[37]以埃博拉病毒的基因組DNA 為模板擴增GP 基因，插入pLaSota 得pLa-GP，加輔助質粒轉染DF1 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-GP 表達的100 kD的GP 抗原；將107PFU 疫苗滴鼻或支氣管注射接種恒河猴，初次接種后4 周進行加強，提示免疫組血清IgG和中和抗體以及鼻、支氣管分泌液的SIgA均在初次接種后4～8 周上升，初次接種后8 周上升到較高程度，FACS檢測表明PBMC中IFN-γ+或TNF-α+的 CD8+T 細胞增加。

5.2 馬爾堡病毒

馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）是馬爾堡出血熱的病原體。糖蛋白GP 是一種主要結構蛋白，具有較好的免疫原性[38]。胡旭東等[39]將2046 bp的 GP 基因插入 pBSK 得 pBS-GP，與 pBRN-FL重組得pBRN-GP，加輔助質粒轉化BHK-21 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清結合rNDV-GP 表達的 40 kD的 GP 抗原；將 107EID50疫苗肌肉注射BALB/c 鼠，初次接種后3 周進行加強，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG 上升。

6 重組新城疫病毒抗小RNA病毒

6.1 腸病毒71型

腸病毒71 型（Enterovirus type 71，EV71）可引起幼兒手足口病，常伴發中樞神經系統并發癥。VP1 是一種核殼蛋白，將其接種動物可產生較好的抵抗力[40]。 Sivasamugham等[41]將VP11-100基因插入pTrcHis2-NPt 得pNPt-VP11-100，將其轉化大腸桿菌 Top10，IPTG 誘導，Western 印跡發現感染血清可結合重組病毒表達的60 kD的NPt-VP11-100融合蛋白；將200 μg 重組蛋白加弗氏佐劑皮下注射接種新西蘭大白兔，初次接種后4、6 周加強2 次，初次接種后10 周提示免疫組血清IgG 上升。Ch'ng等[42]將10 μg 重組蛋白加弗氏佐劑皮下注射接種BALB/c 鼠，初次接種后1 周進行加強，初次接種后2 周提示免疫組血清IgG 上升，此時腹腔注射10 LD50（半致死劑量）的腸病毒71 型P5 株進行攻擊，攻擊后5 d 免疫組和對照組的存活率分別為94.7%（18/19）和 40%（6/15），免疫組腦脊髓和骨骼肌的病理變化明顯減輕。

6.2 脊灰病毒

脊灰病毒（Poliovirus）可引起小兒麻痹癥。核殼蛋白的前體可被病毒蛋白酶3CD 分解為核殼蛋白P1，P1 和3CD 共表達后可形成病毒樣顆粒（VLP），誘導宿主產生保護性抗體[43]。Viktorova等[44]以脊灰病毒的基因組DNA 為模板擴增P1/3CD 基因，將其插入 pLaSota 得 pLa-P1/3CD，加輔助質粒轉化HeLa 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-P1/3CD 表達的80 kD的 P1 蛋白和 70 kD的 3CD 蛋白；將 105PFU 疫苗滴鼻接種Hartley 豚鼠，初次接種后3 周進行加強，提示免疫組血清IgG、IgM 和中和抗體在初次接種后3～11 周上升，初次接種后9 周上升到較高程度，陰道分泌物IgG 和中和抗體在初次接種后3～9 周上升，初次接種后7 周上升到較高程度。

7 重組新城疫病毒抗其他病毒

7.1 Ⅰ型人類免疫缺陷病毒

Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（Human immunodefi?ciency virus type 1，HIV-1）是獲得性免疫缺陷綜合征的病原體。gp160 和gp41 是2 種有效的疫苗候選抗原分子。Carnero 等[45]將密碼子優化的Gag 序列（optGag）插入pSL1180 得pSL-optGag，加新城疫病毒HB1 株共同轉染DF1 細胞株，篩選重組病毒，Western印跡發現感染血清可結合rNDV-optGag 表達的49 kD的 optGag 蛋白；將 5×105PFU 疫苗滴鼻接種 BALB/c 鼠，初次接種后3 周進行加強，初次接種后6 周提示脾IFN-γ+的CD8+T 細胞增加，此時用106PFU 表達Gag 蛋白的重組牛痘病毒（VV-Gag）進行滴鼻攻擊，攻擊后5 d發現肺組織的病毒負荷下降至1/100。Maamary 等[46]將 Gagp41 基因插入 pLaSota 得 pLa-Gagp41，加輔助質粒轉染Vero 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-Gagp41 表達的 70 kD的 Gagp41 抗原；將 5×105PFU 疫苗滴鼻接種C×B6F1 鼠，初次接種后4 周進行加強，初次接種后5 周經ELISPOT 證實脾IFN-γ+、IL-2+、TNF-α+的CD4+或CD8+T 細胞數增加，初次接種后8 周提示免疫組血清IgG上升，此時用106PFU重組VV-Gag進行滴鼻攻擊，攻擊后6 d 免疫組肺組織的病毒負荷下降至1/106。

Khattar 等[47]將 gp160 基因插入 pCR2-1 得 pCR2-1-gp160，與pLaSota 重組得pLa-gp160，加輔助質粒轉染DF1 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-gp160 抽提的總RNA 為模板，采用RT-PCR 方法可克隆出2598 bp的 gp160 基因片段；將 106PFU 疫苗滴鼻或肌肉注射豚鼠，初次接種后2、4 周加強2 次，初次接種后 6 周提示免疫組血清 IgG、IgGa 和 IgG1 上升，陰道分泌物SIgA 升高，血清中和抗體的滴度分別為1∶164 和1∶44；隨后又構建了rNDV-Gag/env，Western印跡發現感染血清可結合rNDV-Gag/env 表達的120 kD的 Gp160 蛋白和 55 kD的 p55 蛋白；將 105PFU 疫苗滴鼻接種豚鼠，初次接種后3 周進行加強，發現免疫組血清IgG 在初次接種后3～8 周上升，初次接種后7 周上升到較高程度，陰道分泌物SIgA 在初次接種后3～8 周上升，初次接種后6 周上升到較高程度，初次接種后 4 周經 ELISPOT 證實脾 IFN-γ+SFC 數增加，初次接種后9 周用107.2TCID50重組VV-Gag 進行滴鼻攻擊，攻擊后5 d 免疫組的肺組織病毒負荷下降至1/1000。

7.2 傳染性法氏囊病毒

傳染性法氏囊病毒（Infectious bursal diseasevirus，IBDV）是禽類法氏囊病的病原體。VP2 是一種構成病毒粒子的結構蛋白，將其接種動物可產生保護性抗體[48]。Huang 等[49]以傳染性法氏囊病毒GLS-5 株總RNA 為模板擴增VP2 基因，插入pGEM-TZ(+)得 pGEM-VP2，與pLaSota重組得pLa-VP2，加輔助質粒轉染DF1 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-VP2 抽提的總RNA 為模板,采用RT-PCR 方法可克隆出1359 bp的VP2 基因片段；將1×104ELD50疫苗點眼接種1 d 齡仔雞，初次接種后3 周加強1 次，初次接種后6 周提示免疫組血清 IgG 和中和抗體上升，滴度分別為 1∶7120 和 1∶982，此時用103EID50傳染性法氏囊病毒GLS-5 株進行點眼攻擊，攻擊后3 d 免疫組和對照組的存活率分別為100%（10/10）和0（0/10）。

Ge 等[50]將VP2基因插入pBRN-FL得pBRNVP2，加輔助質粒轉染BHK-21 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可識別rNDV-VP2表達的 42 kD的 VP2 抗原；將 2×106EID50疫苗點眼滴鼻接種7 d 齡仔雞，接種后3 周用105EID50傳染性法氏囊病毒GX 株進行點眼滴鼻攻擊，攻擊后8 d 免疫組和對照組的存活率分別為100%（12/12）和 0（0/8）；隨后將 105.5、104.5、103.5和 102.5EID50疫苗分別卵內注射接種18 d 齡雞胚，注射后22 d 仔雞孵出，此時用103EID50傳染性法氏囊病毒GX 株進行點眼滴鼻攻擊，攻擊后10 d 各免疫組和對照組的存活率分別為74%（37/50）、82%（41/50）、80%（40/50）、86%（43/50）和14%（7/50）。

7.3 諾如病毒

諾如病毒（Norovirus，NoV）可引起病毒性胃腸炎，OPF2 編碼的VP1 是一種主要核殼蛋白，該蛋白可自身聚合成病毒樣顆粒，將其接種動物可產生有效的抵抗力[51]。Kim 等[52]以諾如病毒VA387株的總RNA 為模板擴增1644 bp的VP1 基因，插入pLaSota 得 pLa-VP1，加輔助質粒轉染DF1 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合 rNDV-VP1 表達的 58 kD的 VP1 蛋白；將 106EID50疫苗滴鼻接種 BALB/c 鼠，初次接種后 2、4 周加強2 次，初次接種后6 周提示免疫組血清IgG 和IgG2a 上升，糞 SIgA 升高，ELISPOT 發現脾 IFN-γ+或TNF-α+SFC 數增加。

7.4 非洲豬瘟病毒

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）可引起非洲豬瘟。P30 和P72 是2 種有效的保護性抗原，具有較強的免疫原性[53]。Chen 等[54]以非洲豬瘟病毒 E70 株的 DNA 為模板，擴增 p30 和 p72 基因，插入pBSK得pBS-p30/p72，與pLaSota重組得pLa-p30/p72，加輔助質粒轉染BHK-21 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-p30/p72 抽提的總RNA 為模板，采用RTPCR 方法可克隆出 600 bp的 P30 基因片段，Western印跡發現感染血清可結合rNDV-p30/p72 表達的30 kD的 P30 蛋白和 72 kD的 P72 蛋白；將 108EID50重組NDV-p30 肌肉注射BALB/c 鼠，初次接種后2、4 周加強2 次，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG上升；接著將108EID50重組NDV-p72 肌肉注射BALB/c 鼠，初次接種后 2、4、6 周加強 3 次，初次接種后 8 周提示免疫組血清IgG、IgG1 和IgG2a 上升，脾細胞明顯增殖，ELISPOT證實脾IFN-γ+或IL-4+SFC顯著增加。

7.5 牛皰疹病毒1型

牛皰疹病毒1型（Bovine herpesvirus type 1，BHV-1）是牛傳染性鼻支氣管炎的病原體。糖蛋白gD 是一種包膜蛋白，參與病毒黏附并進入宿主細胞，可誘導有效的保護力[55]。Khattar 等[56]以牛皰疹病毒1型的基因組DNA 為模板擴增gD 基因，插入pCR2-1得pCR2-1-gD，與pLaSota 重組得pLa-gD，加輔助質粒轉化MDBK 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可識別rNDV-gD 表達的71 kD的gD 單體蛋白和140 kD的gD 二聚體蛋白；將106PFU 疫苗滴鼻接種12 周齡小牛，提示免疫組血清IgG 和鼻咽拭子SIgA 在接種后1～4 周上升，接種后 2 周上升到較高程度，接種后 4 周用2×107PFU 牛皰疹病毒 1 型Cooper 株進行滴鼻攻擊，攻擊后10 d 免疫組的鼻咽拭子病毒負荷下降至1/1000。

7.6 西尼羅病毒

西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）可引起西尼羅熱，前膜蛋白prM 和包膜蛋白E 是病毒表面的糖蛋白，可在病毒表面形成異二聚體，將其接種動物可產生較好的抵抗力[57]。Wang 等[58]人工合成 prM/E 基因，插入 pLaSota 得 pLa-prM/E，加輔助質粒轉化BHK-21 細胞，篩選重組病毒，Western印跡發現感染血清可結合rNDV-prM/E表達的25 kD的prM蛋白和45kD的E蛋白；將 2×109EID50疫苗肌肉注射接種兒馬，初次接種后3 周進行加強，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG 和中和抗體上升；隨后將2×108EID50疫苗肌肉注射或1×1010EID50疫苗口服接種4 周齡仔雞或幼鵝，初次接種后3 周進行加強，初次接種后5 周提示免疫組血清IgG 和中和抗體顯著上升。

7.7 鵝細小病毒

鵝細小病毒（Goose parvovirus，GPV）可引起幼鵝瘟，將核殼蛋白VP3 接種幼鵝可產生保護性抗體[59]。Wang 等[60]以鵝細小病毒 GD01 株為模板擴增 VP3 基因，插入 pCI-MNA-1 得 pCI-VP3，將其導入新城疫病毒pLaSota 株后再轉染BHK-21 細胞，篩選重組病毒，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-VP3 表達的 70 kD的 VP3。將 106EID50疫苗皮下注射4 d 齡幼鵝，初次接種后2 周進行加強，提示免疫組血清中和抗體在初次接種后3～12 周上升，初次接種后6 周上升到較高程度。

7.8 豬圓環病毒Ⅱ型

豬圓環病毒Ⅱ型（Porcine circovirus type 2，PCV2）可引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征，ORF2編碼的衣殼蛋白Cap 可自身聚合為病毒樣顆粒，將其接種仔豬可產生有效的抵抗力[61]。Cap△41 是刪除NLS 序列的Cap 基因，王子龍等[62]以豬圓環病毒Ⅱ型 G 株為模板，擴增 Cap/Cap△41 基因，插入pBRN-FL 得 pBRN-Cap/Cap△41，加輔助質粒轉染BHK-21 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-Cap/Cap△41 提取的 DNA 為模板，采用 PCR 可克隆出 750 bp的 Cap 基因片段和 600 bp的 Cap△41 基因片段，共聚焦顯微鏡顯示rNDV-Cap/Cap△41 感染的細胞中存在 NDV 蛋白及 PCV2的 Cap、Cap△41 蛋白，其中Cap 蛋白位于胞核，而Cap△41 位于胞漿中。

7.9 傳染性喉氣管炎病毒

傳染性喉氣管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）可引起傳染性喉氣管炎，糖蛋白gB 與病毒吸附和進入細胞有關，是一種保護性抗原分子[63]。孫娜娜等[64]以傳染性喉氣管炎病毒LJS09 株的DNA為模板擴增gB 基因，插入pBR-FL 得pBR-gB，加輔助質粒轉染BSR-T7/5 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-gB 抽提的總 RNA 為模板，采用 RT-PCR 方法可克隆出1323 bp的gB 基因片段，Western 印跡發現感染血清可結合rNDV-gB 表達的gB 抗原。

8 重組新城疫病毒抗細菌

8.1 雞毒支原體

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）可引起雞呼吸道感染。TM1 基因編碼一種29 kD的蛋白，將其免疫仔雞可誘導一定的保護力[65]。馮秋霞等[66]以雞毒支原體的基因組DNA 為模板擴增 TM1 基因，插入 pBRN-FL 得 pBRN-TM1，加輔助質粒轉染BHK-21 細胞，篩選重組病毒，以從rNDV-TM1 提取的總RNA 為模板，采用PT-PCR方法可克隆出1960 bp的TM1 基因片段；將106ELD50疫苗點眼滴鼻接種6 d 齡仔雞，提示免疫組血清IgG 在接種后1～3 周上升，接種后3 周上升到較高程度；在接種后3 周用5×108CFU 雞毒支原體有毒株進行氣管內注射攻擊，攻擊后2 周免疫組和對照組的保護力分別為90%（9/10）和0（0/10）。

8.2 博氏疏螺旋體

博氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）可引起萊姆病。基礎膜蛋白BmpA 是一種外膜蛋白，與萊姆病的關節炎發生密切相關[67]。Xiao 等[68]以博氏疏螺旋體的基因組DNA 為模板擴增BmpA 基因，與組織纖溶酶原激活物（tpA）基因融合后，插入pLaSota 得pLa-tpA-BmpA，加輔助質粒轉染小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3，篩選重組病毒，Western印跡發現感染血清可結合rNDV-tpA-BmpA 表達的 42 kD的 BmpA 蛋白；將 106PFU 疫苗滴鼻接種倉鼠，初次接種后2 周進行加強，初次接種后3 周提示免疫組血清IgG 上升，此時腹腔注射108CFU班氏疏螺旋體進行攻擊，攻擊后12 d 取關節、心和膀胱組織，熒光定量PCR 檢查細菌負荷，發現免疫組的關節細菌負荷明顯減少，膀胱細菌負荷輕微降低，心臟細菌負荷則無明顯變化。

9 結語

新城疫病毒的基因組結構和功能已研究得比較清楚，血清型僅有1 個，遺傳性狀比較穩定，毒株重組和毒力返強的機會微乎其微，而且其復制過程僅在胞質中完成，沒有DNA 階段，肯定不能與宿主細胞的DNA 發生結合；新城疫病毒能容納附加的RNA 節段，可作為載體向細胞內運輸靶抗原，可能得到免疫預防的理想效果；新城疫病毒僅編碼8 種內在蛋白，明顯減少了內在蛋白與目的蛋白競爭免疫顯性表位的可能性；新城疫病毒的基因組可以插入大于4 kb的外源基因，能夠穩定表達，可誘導宿主產生體液免疫、局部黏膜免疫及細胞免疫；新城疫病毒僅感染禽類，人體不會存在抗NDV的抗體；重組新城疫病毒可通過飲水、噴霧、滴鼻、點眼或注射多種途徑接種，方便高效，簡單易行；重組新城疫病毒對呼吸道具有親嗜性，插入的目的基因通常不改變新城疫病毒的復制、致病性和嗜向性；重組新城疫病毒對基因交換具有抵抗性，可在常規實驗室進行操作；重組新城疫病毒在細胞或雞胚經過多次傳代仍可高效穩定表達外源基因，而且具有高效價的雞胚生長特性，生產成本較低；新城疫病毒的基因組僅有1 個啟動子，基因間隔序列可降低其轉錄水平，所以插入位點的選擇對于重組病毒的復制以及外源基因的表達十分關鍵；新城疫病毒的基因組含有6 個轉錄單位NP、P、M、F、HN、L，目的基因插入位點愈靠近3'端，表達水平愈高。

分子生物學技術的發展，必將推動病毒或細菌的基因組學、蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學以及表觀遺傳學的研究進展，這對于闡明病毒或細菌蛋白的抗原結構與功能的關系，篩選新的抗原分子，構建由各期抗原分子組成的多期多價疫苗具有重要指導意義，有必要研究這些疫苗的免疫原性、轉化效率、MHC 限制性以及能否長期在宿主體內表達。在重組新城疫病毒的構建過程中，要深入了解各個啟動子的特性，啟動子與終止子的調控關系，分析外源基因的特點，完善重組病毒的構建平臺，提高外源基因的表達量，增強免疫原性的穩定性；研制新型佐劑、疫苗載體和制備融合抗原，提高疫苗的免疫原性；積極探索重組新城疫病毒的免疫劑量、免疫次數、免疫間隔時間和免疫途徑等。期待這些焦點的闡明將重組新城疫病毒疫苗的研究帶入一個新時代。