植物鉀離子通道AKT1的研究進(jìn)展

楊玲琴 劉敬 李魏 戴良英

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128）

鉀是植物所必需的三大營養(yǎng)元素之一，也是唯一以較高濃度存在的一價(jià)陽離子，約占植物總干重的2%-10%［1］。鉀是一種大量元素，對植物的生長發(fā)育有著至關(guān)重要的作用。它參與植物體內(nèi)的多種生理活動，如植物的氮代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)的合成、滲透調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞膜的極化等。鉀離子可以提高植物對干旱、鹽堿等非生物脅迫的耐受性，同時(shí)也可以抵抗真菌等生物脅迫［2］。除上述生理功能外，鉀在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也有非常重要的作用，鉀肥的濃度直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。植物細(xì)胞質(zhì)中鉀離子的濃度需要保持在100-200 mmol/L之間，植物才能維持正常的生理功能［3］，但土壤中的鉀離子濃度（10-100 μmol/L）與細(xì)胞質(zhì)中的含量相比低3-4個(gè)數(shù)量級［4］。因此，植物需要通過其體內(nèi)的鉀離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)從土壤中獲得并富集足夠濃度的鉀離子。其中，植物體內(nèi)各種類型的鉀離子通道在這個(gè)過程中起到了至關(guān)重要的作用。本文主要介紹鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與調(diào)控鉀離子吸收的機(jī)制及其在生長發(fā)育、非生物脅迫與生物脅迫方面的功能。

1 鉀離子通道的簡介及結(jié)構(gòu)

1.1 鉀離子通道

20世紀(jì)80年代，Schroeder等［5］利用膜片鉗技術(shù)在蠶豆（Vicia faba）的保衛(wèi)細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)鉀離子通道的存在。隨后研究人員采用酵母突變體互補(bǔ)法從擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大麥（Hodeum vulgare）、小麥（Triticum aestivum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）等植物中分離到不同類型的鉀離子通道［6］。鉀離子通道實(shí)質(zhì)是一種跨膜蛋白，存在于植物細(xì)胞質(zhì)膜或內(nèi)膜（如液泡膜、其他細(xì)胞器膜）上。根據(jù)鉀離子的流動方向及對電勢的依賴性可將其分成兩類：內(nèi)向整流型鉀離子通道（Inward rectifier K+channel；K+in），外向整流型鉀離子通道（Outward rectifier K+channel；K+out）［7］。內(nèi)向整流型鉀離子通道是植物體吸收鉀離子的主要途徑，該通道的特點(diǎn)是對鉀離子的親和力低、對鉀離子濃度變化敏感、對電壓的依賴性高，這類蛋白主要存在于細(xì)胞的質(zhì)膜上。內(nèi)向整流型鉀離子通道在細(xì)胞膜超極化（Hyperpolarization）的電壓條件下打開，引起胞外的鉀離子內(nèi)流進(jìn)入胞內(nèi)［8］。外向整流型鉀離子通道是植物細(xì)胞中鉀離子外流的重要途徑，對鉀離子有較高的通透性和選擇性，通透性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他一價(jià)陽離子，如 Rb+、Na+、Li+等［9］。外向整流型鉀離子通道是在細(xì)胞去極化（Depolarization）的條件下被激活打開，跨膜電勢較高，引起鉀離子由胞內(nèi)排到胞外［10］。

鉀離子通道依據(jù)蛋白序列和結(jié)構(gòu)特征的不同，又可分為3大類：Shaker 家族通道、Tandem-Pore K+（TPK）通道和Kir-like通道（K+Inward Rectifier-Like Channel）［11］。其中，Sharker家族通道是最早被發(fā)現(xiàn)且研究最深入的鉀離子通道家族。近年來，人們已從多種植物或同種植物的不同組織器官中鑒定到30多個(gè)Shaker 鉀離子通道基因［12］。TPK通道也被稱為KCO通道即鉀離子通道（K+channel）、鈣激活（Ca2+activate）和外向整流（Outward-rectifying）的縮寫。1997年，第一個(gè)TPK通道家族成員KCO1在擬南芥中鑒定出［13］。TPK通道是動物串聯(lián)孔（TWIK-like）通道的植物同源物［12］。在擬南芥基因組序列數(shù)據(jù)庫中搜索TPK1同源序列時(shí)發(fā)現(xiàn)動物TPK1同源序列KCO3，導(dǎo)致KCO3初始分類成單獨(dú)的植物Kirlike通道家族［14］。系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)證明Kir-like通道實(shí)際上屬于TPK家族，起源于進(jìn)化上最近的基因重復(fù)和部分缺失事件［15-16］。因此有學(xué)者認(rèn)為Kir-like通道不是一個(gè)獨(dú)立的鉀離子通道家族［11］。

1.2 Shaker鉀離子通道的結(jié)構(gòu)

1992年，Sentenagc等［17］利用酵母的鉀吸收缺陷突變體，從擬南芥cDNA文庫中克隆并分離得到AKT1基因。鉀離子通道AKT1是典型的Shaker家族成員。植物Shaker通道蛋白N端和C端均位于胞質(zhì)內(nèi)，N端是由大約60個(gè)氨基酸組成的一個(gè)很短的結(jié)構(gòu)域；C端在第6個(gè)跨膜片段末尾，它含有一個(gè)約80個(gè)氨基酸殘基組成的C-接頭，一個(gè)環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)（Cyclic nucleotide-binding domain；CNBD）、一個(gè)錨蛋白區(qū)（Ankyrin-related domain；ANKY）和一個(gè)富含疏水酸性殘基的KHA域［18-19］。大部分Shaker型鉀離子通道家族都存在錨蛋白區(qū)。錨蛋白有助于鉀離子通道與細(xì)胞骨架的連接，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞溶質(zhì)，促進(jìn)蛋白與蛋白之間的相互作用［20］。Shaker家族成員具有6個(gè)跨膜鏈（S1-S6），S1-S4這4條跨膜鏈與鉀離子通道感受并響應(yīng)膜電位變化的能力密切相關(guān)。S4跨膜鏈每隔兩個(gè)氨基酸殘基就有一個(gè)帶正電荷的精氨酸或賴氨酸重復(fù)序列（Arg/Lys-Xaa-Xaa-Arg/Lys），這個(gè)結(jié)構(gòu)的存在可以讓S4在膜上移動，從而引起了膜通道構(gòu)象發(fā)生變化，起到控制通道孔的開放與關(guān)閉的作用［21］。S5與S6之間含有一個(gè)P環(huán)（Pore）結(jié)構(gòu)域，由一段嵌入細(xì)胞膜內(nèi)的多肽片段，構(gòu)成通道孔。一般單個(gè)鉀離子通道是同源四聚體結(jié)構(gòu)，它由4個(gè)亞基對稱圍成一個(gè)恰好讓單個(gè)鉀離子通過的孔道。Shaker型鉀離子通道能夠形成異源四聚體結(jié)構(gòu)，這也是Shaker通道的一個(gè)重要的特點(diǎn)。這個(gè)結(jié)構(gòu)使得植物能相對獨(dú)立的調(diào)節(jié)每個(gè)器官或組織中細(xì)胞內(nèi)的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性［22］。

2 鉀離子通道AKT1的功能

2.1 AKT1影響植物的生長發(fā)育

土壤中K+濃度過低影響植物正常生長發(fā)育。在低鉀條件下，osakt1突變體的冠部高度、植株高度、根部和冠部的生物量均顯著低于野生型。osakt1突變體與野生型相比其抽穗、灌漿和種子成熟所需的時(shí)間明顯更長。種子成熟后統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的農(nóng)業(yè)性狀發(fā)現(xiàn)，osakt1突變體主穗穗粒數(shù)、主穗飽滿種子比例和百粒重都低于野生型。這些結(jié)果表明水稻OsAKT1功能的缺失會影響水稻的生長發(fā)育［23］。我們的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥akt1突變體與野生型相比有明顯的晚花現(xiàn)象，還發(fā)現(xiàn)在四周齡的時(shí)候akt1突變體的葉片及整個(gè)植株直徑也明顯的小于野生型。將Atakt1突變體幼苗置于低鉀環(huán)境下生長，其根毛的生長受到抑制。在低鉀培養(yǎng)基上生長，擬南芥akt1突變體植株表現(xiàn)出低鉀敏感表型和鉀離子含量降低［24-25］。擬南芥akt1突變體根缺乏內(nèi)向整流鉀離子通道的功能，在鉀離子濃度為100 μmol/L或更低時(shí)，突變體生長受到抑制，同時(shí)也檢測不到鉀離子內(nèi)流［26］。AKT1介導(dǎo)的鉀離子吸收能促進(jìn)植物腫瘤細(xì)胞的增殖，當(dāng)AKT1被敲除時(shí)腫瘤細(xì)胞的增殖發(fā)育過程受到明顯的抑制［27］。除了AKT1功能缺失導(dǎo)致植物鉀離子含量減少外，銫離子也能夠影響植物體內(nèi)鉀離子的含量。銫離子對植物目前沒有已知的有益作用［28］。銫離子對AKT1和其他鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白/通道，通過與鉀離子競爭或阻斷的方式，導(dǎo)致植物體內(nèi)K+積累減少，從而使得植物生長遲緩［29］。因此，在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育方面鉀離子通道AKT1發(fā)揮重要作用。

2.2 AKT1參與植物抗旱耐鹽性

鉀離子影響作物生產(chǎn)的很多方面，包括產(chǎn)量、對病原體的抗性和對非生物脅迫的耐受性（如鹽度、倒伏和干旱）［30］。植物響應(yīng)干旱脅迫中的一種方式是通過吸收并積累大量的溶質(zhì)（如K+、Na+和脯氨酸等）［31］，降低細(xì)胞滲透勢，從而增強(qiáng)植物細(xì)胞的吸水能力。AKT1主要從兩個(gè)方面參與調(diào)控植物的抗旱性。首先，AKT1能增強(qiáng)植物根吸收鉀離子的能力。將水稻OsAKT1基因超表達(dá)后，在干旱條件下該轉(zhuǎn)基因水稻生長良好，根中積累較多的鉀離子；相反，水稻Osakt1突變體生長不良，根中鉀離子含量明顯減少［32］。由此表明，OsAKT1轉(zhuǎn)基因植株根中的鉀離子積累，改善細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力，從而增強(qiáng)抗旱能力。其次，AKT1通過調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動來維持植物體內(nèi)的水分平衡。干旱脅迫下，擬南芥akt1突變體植株的失水量和蒸騰速率明顯低于野生型。由此可見，擬南芥中AKT1基因的沉默使得保衛(wèi)細(xì)胞K+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體系受損，氣孔導(dǎo)度下降，從而增強(qiáng)植物對水分脅迫的反應(yīng)［33］。這些研究結(jié)果表明，AKT1在介導(dǎo)植物保衛(wèi)細(xì)胞鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)，調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動及維持細(xì)胞水分平衡中發(fā)揮著重要的作用。

鹽逆境對植物造成的危害最初表現(xiàn)為滲透脅迫，然后因離子失調(diào)引起Na+毒害和營養(yǎng)元素的虧缺，最后引起氧化脅迫導(dǎo)致植物膜通透性改變、生理生化代謝紊亂和有毒物質(zhì)的積累，進(jìn)而造成植物生長發(fā)育和形態(tài)建成的改變［34-35］。植物通過維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較高的K+/Na+比的策略來增強(qiáng)對鹽脅迫的耐受性［36］。先前的研究表明，番茄中的AKT1和HAK5參與鹽脅迫應(yīng)答和在鹽條件下維持K+/Na+的動態(tài)平衡中起到關(guān)鍵的作用［37］。水稻鉀離子吸收通道OsAKT1對鹽脅迫非常敏感，能通過影響水稻根部對Na+的吸收來維持植株內(nèi)的鉀離子平衡［38］。棉花CCRI49在鹽脅迫期間通過AKT1、SOS1和HAK5減少了ROS的過量產(chǎn)生，同時(shí)在根系膜上維持著K+高于Na+的選擇性吸收［39］。鹽地堿蓬SsAKT1能介導(dǎo)高親和力和低親和力K+攝取，鹽脅迫下促進(jìn)植物體內(nèi)鉀離子積累，從而增強(qiáng)植物的耐鹽性［40］。在擬南芥中超表達(dá)小花堿茅PtAKT1與野生型相比更加的耐鹽。在正常、饑餓和NaCl脅迫條件下，過表達(dá)PtAKT1增加了擬南芥的鉀離子含量，而根和莖中Na+積累量均有所下降［41］。表明PtAKT1增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)鉀離子含量的積累，進(jìn)而增強(qiáng)植物的耐鹽性。以上研究結(jié)果表明，AKT1在維持植物體內(nèi)較高的鉀離子含量，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)K+/Na+平衡以及增強(qiáng)植物耐鹽性等方面具有非常重要的作用。

2.3 鉀離子通道AKT1與植物抗病性

植物營養(yǎng)狀況可以影響植物對病原體入侵的免疫力。鉀是植物生長發(fā)育所必需的，同時(shí)它也有助于植物抵抗病原物，高鉀可以降低真菌、細(xì)菌及病毒對作物的危害［42］。研究表明，OsAKT1不僅在水稻吸收鉀離子的過程中發(fā)揮重要的作用［43］，還參與水稻的抗病反應(yīng)。稻瘟病產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白AvrPiz-t以鉀離子通道為靶點(diǎn)，破壞植物的免疫功能，干擾OsAKT1與其上游調(diào)節(jié)因子OsCIPK23的關(guān)聯(lián)。Avr-Piz-t與水稻鉀離子通道OsAKT1相互作用，抑制Os-AKT1介導(dǎo)的鉀離子電流，導(dǎo)致osakt1突變體鉀離子含量降低，對稻瘟病的抗性降低［44］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AKT1正調(diào)控對病原菌草莓灰霉的抗病性。接菌草莓灰霉后Atakt1與野生型相比病斑直徑和死亡率均高于野生型。從機(jī)制上而言，鉀離子主要從以下幾個(gè)方面增強(qiáng)植物對病害的抗性：（1）植物施鉀肥可使植物提前開花完成生育期，成功避開病害爆發(fā)期；（2）通過調(diào)節(jié)植物形態(tài)學(xué)提高植物抗病性。施鉀肥可以讓植物角質(zhì)層、表皮層和細(xì)胞壁更加的厚實(shí)，形成堅(jiān)硬的第一道防線以抵抗病原物入侵；（3）通過調(diào)控植物體內(nèi)代謝，如酚代謝、碳氮代謝和活性氧代謝等進(jìn)而調(diào)控植物的抗病性［45-46］。

3 鉀離子通道AKT1的調(diào)控機(jī)制

植物通過鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白從環(huán)境中吸收鉀離子。它們之間通過復(fù)雜的分工與合作共同調(diào)控植物不同組織及細(xì)胞的鉀離子濃度和滲透勢等的變化，鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的實(shí)現(xiàn)離不開調(diào)控機(jī)制。為了能夠精確調(diào)控鉀離子通道，植物體進(jìn)化出多種機(jī)制來調(diào)節(jié)它的表達(dá)狀態(tài)和轉(zhuǎn)運(yùn)活性，以滿足植物不同部位、不同生理階段和不同生長環(huán)境的生理需求［47］。鉀離子通道的調(diào)控機(jī)制有很多類型，如轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控、翻譯后調(diào)控、定位調(diào)節(jié)、pH調(diào)節(jié)、電壓調(diào)控等。最近的研究發(fā)現(xiàn)在藍(lán)光（450 nm）誘導(dǎo)下，CRY2與CIB1結(jié)合使嵌合在細(xì)胞溶質(zhì)中的蛋白激酶AKT1募集至質(zhì)膜，同時(shí)使其被激活［48］。Sentenac等［17］從擬南芥中克隆得到第一個(gè)高等植物Shaker型鉀離子通道AtAKT1。下文重點(diǎn)介紹其中兩種調(diào)控方式。

3.1 CBL/CIPK的磷酸化調(diào)控鉀離子通道AKT1

研究表明，鉀離子通道AKT1最常見的蛋白調(diào)控方式是磷酸化或去磷酸化，ATP或非水解ATP類似物可影響鉀離子通道的活性。到目前為止CBL（Calcineurin B-like protein）/CIPK（CBL-Interacting Protein Kinase）的磷酸化調(diào)控鉀離子通道AKT1的研究最為深入。

CBL蛋白是由兩個(gè)相連的短連接域折疊形成的球形區(qū)結(jié)構(gòu)，擬南芥和水稻CBL蛋白都含有四個(gè)典型的EF-hand結(jié)構(gòu)域［49-50］。CBL下游特異的底物是CIPK蛋白激酶。CIPKs是植物中特有的絲/蘇氨酸蛋白激酶，具有兩個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域：N端類SNF1（Sucrose non-fermenting-1）蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)與CBL互作的C端高度可變調(diào)節(jié)區(qū)NAF結(jié)構(gòu)域［51］。研究發(fā)現(xiàn)CBL蛋白的C末端都含有一個(gè)FPSF基序，F(xiàn)PSF中的絲氨酸殘基能被其互作的CIPK蛋白磷酸化，進(jìn)而提高CBL與CIPK蛋白之間結(jié)合的強(qiáng)度，同時(shí)還能增強(qiáng)CBL-CIPK復(fù)合體對下游靶蛋白的磷酸活性［52］。

在擬南芥中的研究結(jié)果表明磷酸化AKT1需要CIPK23和CBL1/CBL9共同參與才能被激活［20］。將CIPK23與被分段后的AKT1胞內(nèi)區(qū)進(jìn)行互作分析，能與CIPK23互作的片段是含有完整Anky區(qū)域的片段，這研究結(jié)果說明AKT1與CIPK23之間的互作依賴于AKT1中的Anky區(qū)域［18］。在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中其他植物的Shaker鉀離子通道也能被CBL1/CIPK23調(diào)控，如葡萄中的 VvK1.1和 VvK1.2［53-54］、玉米中的ZMK1等［55］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)多種CBL和CIPKs與AKT1之間存在互作關(guān)系，例如在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中CIPK6和CIPK16也同樣能與CBL1結(jié)合一起激活A(yù)KT1。CBL10能直接結(jié)合AKT1，并以濃度依賴性和CIPK非依賴性的方式降低AKT1的活性［56］。這個(gè)高度復(fù)雜且靈敏的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有其他的組成部分。如PP2C磷酸酶AIPI，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中它與CIPK23的作用相反，與AKT1結(jié)合通過去磷酸化作用使其失活［57］。Lan等［58］在研究PP2Cs和CBL-CIPK途徑之間的相互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)PP2C磷酸酶與CIPK-CBL復(fù)合體相互作用，以抑制激酶磷酸化活性使AKT1去磷酸化。綜上所述，CBL、CIPK和PP2C提供了一個(gè)全面的系統(tǒng)來調(diào)節(jié)由AKT1介導(dǎo)的K+攝取，為植物提供強(qiáng)大的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以響應(yīng)廣泛的環(huán)境變化。

3.2 通過異源聚合進(jìn)行內(nèi)部調(diào)節(jié)

動植物Shaker鉀離子通道都具有典型的四聚體結(jié)構(gòu)，當(dāng)4個(gè)蛋白亞基相同時(shí)組成同源四聚體通道，當(dāng)來自同一家族但是4個(gè)蛋白亞基不同時(shí)組成的是異源四聚體通道。與同源四聚體通道相比，異源四聚體通道具有新的通道特性［59］。植物Shaker鉀離子通道中存在這種異源聚合方式。通過異源聚合的調(diào)控方式，鉀離子通道的活性被靈活的調(diào)控，使得植物更加適應(yīng)逆境脅迫，以及滿足自身生理需求。

AKT1除了受激酶和磷酸酶調(diào)控外還受到AtKC1的調(diào)控。AtKC1是內(nèi)向整流型Shaker鉀離子通道中的調(diào)節(jié)子或沉默α亞基，對四聚體的鉀離子通透能力產(chǎn)生抑制作用［60］。酵母雙雜交結(jié)果顯示AtKC1與AKT1能夠相互作用［61］。AtKC1將AKT1的激活閾值偏向更負(fù)值，抑制AKT1在胞外1 mmol/L K+條件下鉀離子外流，從而增強(qiáng)擬南芥的低鉀耐受性［62］。研究發(fā)現(xiàn)AtKC1與AKT1形成聚合結(jié)構(gòu)，除了影響活化閾值外，AKT1-AtKC1異聚體中孔通道對鉀離子依賴性發(fā)生了改變。AKT1-AtKC1異聚體的孔通道在較高的鉀離子濃度下比AKT1同聚體的孔通道更塌陷［55］。此外，SNARE（Soluble N-ethylmaleimidesensitive factor protein attachment protein receptor）蛋白SYP121（Syntaxin protein 121）與AtKC1相互作用形成復(fù)合體，共同調(diào)節(jié)AKT1鉀離子通道的活性［63］。

4 展望

從植物營養(yǎng)學(xué)界提出植物中存在鉀離子通道，到編碼鉀離子通道蛋白的基因被克隆出來，并且人們對其蛋白結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)部位和生理功能等方面也有了深入研究，該文綜述了植物鉀離子通道及其分類、Shaker鉀離子通道的結(jié)構(gòu)特征、AKT1影響植物的生長發(fā)育、AKT1在非生物脅迫和生物脅迫中的功能以及鉀離子通道AKT1其中的兩種調(diào)控機(jī)制，但是關(guān)于鉀離子通道很多生理功能的具體作用機(jī)制還不是特別的清楚，還需要進(jìn)一步深入研究。因此，基于目前的研究現(xiàn)狀，今后可從以下3個(gè)方面對植物鉀離子通道AKT1進(jìn)行研究。（1）運(yùn)用基因突變、基因敲除、RNA干擾和超表達(dá)等技術(shù)對AKT1在非生物脅迫響應(yīng)中的作用機(jī)理進(jìn)行深入解析；（2）進(jìn)一步闡明鉀離子通道在植物抗病反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)理，并完善鉀離子信號傳導(dǎo)途徑參與調(diào)控植物抗病性的分子遺傳證據(jù)；（3）應(yīng)用分子育種和基因工程技術(shù)，將能介導(dǎo)低鉀及高鉀吸收、提高植物響應(yīng)逆境脅迫的AKT1編碼基因轉(zhuǎn)入作物中，提高作物對鉀離子的吸收利用能力及作物的產(chǎn)量、對病原體的抗性和對非生物脅迫的耐受性。