NGAL在腸道炎癥中作用的研究進展

劉 文 綜述，仝巧云 審校

(三峽大學第一臨床醫學院，湖北宜昌 443000)

中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)又稱脂質運載蛋白-2(lipocalin,lcn-2)、噬鐵蛋白、24P3，是最早發現于中性粒細胞的一種分泌性蛋白，為lipocalin家族成員之一。在體內廣泛參與炎癥及免疫反應、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤形成及侵襲轉移等生理病理過程。NGAL主要表達于中性粒細胞、巨噬細胞、脂肪細胞，在結腸、胃、腎臟、肝臟等組織中也有少量表達，當組織炎癥或上皮細胞損傷時，NGAL的表達明顯升高。本文探討NGAL在腸道炎癥及腫瘤發生中的作用，為這些疾病的治療提供潛在靶點。

1 NGAL的結構及生物學功能

NGAL是由178個氨基酸殘基構成的小分子急性期糖蛋白，以單體、同源二聚體及與基質金屬蛋白酶9(MMP9)共價結合的異源二聚體3種分子形式存在。免疫細胞主要分泌二聚體NGAL，而上皮細胞只分泌單聚體NGAL，決定NGAL形態的分子機制尚不清楚。據推測，NGAL在中性粒細胞中長期儲存形成二聚體，而上皮來源的NGAL分泌速度相對較快則主要由單體組成[1]。與lipocalin家族成員相似，NGAL蛋白多肽鏈的N-末端為310螺旋，C-末端為α-螺旋，中間為八段反平行式β-折疊構成的β折疊桶，β折疊桶一端開放，提供與配體結合的進口，另一端被310螺旋封閉，桶底部內側是由疏水性氨基酸殘基排列形成的親脂性結合位點，可運載固醇類、血小板活化因子、白三稀和脂多糖等介導炎性反應的親脂性小分子。但NGAL的β折疊桶更大、更開放，與配體的結合腔更淺，使其更易于與大分子配體特異性結合，從而較好地發揮其生物學功能。

MMP9在炎癥性腸病中高表達[2]，通過促進細胞因子的釋放及炎癥細胞的聚集加速炎癥的進展，最終造成廣泛的組織損傷。在腫瘤組織中,MMP9介導腫瘤細胞的浸潤，與腫瘤細胞的增殖及侵襲能力密切相關[3-4]。NGAL的β折疊桶封閉端的游離巰基，可與MMP9通過二巰鍵結合，促進pro-MMP9的活化，阻止MMP9的內源性降解，減慢基質金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP-1)對MMP9的失活作用，從而延長MMP9的活性[2]，并由此參與腸道炎癥及腫瘤的進展。

NGAL是天然抗菌免疫的重要組成部分，它可與細菌分泌的鐵載體結合形成NGAL-鐵載體-鐵復合物，阻止細菌從周圍環境中獲取鐵，抑制細菌生長。當組織炎癥時，大腸桿菌增加鐵載體產量以滿足其對鐵的需求，同時中性粒細胞大量分泌NGAL以隔離和中和鐵載體[5]。與野生組小鼠相比，NGAL缺乏的小鼠對細菌感染更為敏感，感染大腸桿菌后表現出更高的病死率。因此，組織炎癥中NGAL誘導的低鐵反應可被看作是對感染的原始保護[6]。此外，NGAL可以和其受體NGALR結合將鐵轉運進入細胞內，構成一條新的鐵轉運途徑，細胞外的低鐵環境可通過減少氧自由基的產生來減輕氧化應激對細胞的損傷。

除了限制腸道細菌對鐵的利用而起抗炎作用外，NGAL對黏膜損傷也具有細胞保護作用，當腸道上皮細胞受損傷時，NGAL可促進存活的上皮細胞、炎癥細胞向損傷后的裸露區域遷移，重建上皮完整性；其再生上皮細胞、隱窩細胞中NGAL的免疫反應活性和mRNA信號均顯著增加[7]。同時，NGAL也可增強巨噬細胞的細菌吞噬作用，與白細胞介素-10(IL-10)缺失小鼠腹腔內巨噬細胞相比，在NGAL/IL-10雙缺失的巨噬細胞中自噬蛋白LC3-Ⅱ的形成明顯減少，重組NGAL可恢復LC3-Ⅱ的形成，從而改善巨噬細胞細菌吞噬功能；在大腸桿菌感染后的NGAL/IL-10雙缺陷小鼠模型中，分泌NGAL的巨噬細胞的植入可減輕結腸炎[8]。腫瘤相關巨噬細胞(TAM)是腫瘤微環境中的重要鐵源，NGAL作為腫瘤微環境中主要的鐵轉運蛋白，在TAM調控的腫瘤鐵穩態中發揮著重要作用。TAM具有較強的吞噬活性，可以有效地回收鐵并與TAM合成的NGAL結合主動釋放到腫瘤微環境中，增加腫瘤微環境中鐵的可用性，促進腫瘤細胞增殖、血管生成和轉移，NGAL缺陷型TAM胞內含鐵量顯著增加，腫瘤微環境中含鐵量減少[9]。NGAL對腫瘤細胞的生物學活性具有雙向調節作用，取決于NGAL的載鐵狀態，鐵負載的NGAL通過NGALR將鐵跨膜轉運到腫瘤細胞內，胞內鐵濃度的增加可抑制凋亡通路中Bim蛋白的表達，進而誘導B淋巴細胞瘤2基因(Bcl-2)合成增加，最終抑制細胞的凋亡信號通路和抑制細胞的凋亡；無鐵NGAL可促進腫瘤細胞內鐵流出進而促進腫瘤細胞凋亡[10-11]，NGAL對鐵轉運的介導使其可能成為腫瘤治療的新靶點。

NGAL也可與其受體NGALR結合誘導中性粒細胞中的細胞外信號調節激酶ERK1和ERK2信號傳導，進而調節中性粒細胞遷移、黏附[12]。研究發現從NGAL缺陷小鼠中提取的中性粒細胞不能滲入感染部位，不能吞噬和殺滅細菌，且中性粒細胞的趨化性和黏附性也明顯減弱[13]。有體外證據表明NGAL能以不依賴鐵的方式增加CD4+T淋巴細胞上人白細胞抗原G的表達，而鐵結合的NGAL也可激活CD4+/ FoxP3+調節性T淋巴細胞，提示其參與細胞介導的適應性免疫[14]。

2 NGAL的分子誘導與表達調節

2.1NGAL與核因子-κB(NF-κB) NGAL啟動子區域包含轉錄因子NF-κB、STAT1、STAT3的結合位點，腸道炎癥時，NF-κB通過激活NGAL的基因轉錄，上調血清NGAL水平來維持正常腸黏膜穩態及對機體的免疫應答，IL-1可通過激活NF-κB促進NGAL的表達[15]；NGAL也可通過負反饋機制調節NF-κB和STAT3通路的激活，減少NF-κB抑制蛋白α(IκBα )降解和STAT3磷酸化來發揮抗炎效應。在小鼠巨噬細胞中，NGAL缺乏導致脂多糖(LPS)誘導的NF-κB、STAT3炎癥信號通路的激活增加，并加劇LPS引起的促炎標志物CD11c、IL-6和NOS的表達，但在無LPS刺激的條件下將重組NGAL導入巨噬細胞時，NGAL對NF-κB、STAT3信號傳導途徑的活化沒有影響，表明NGAL本身不是促炎因子，而是在促炎刺激存在時發揮抗炎作用[16]。

2.2NGAL與TH17細胞相關細胞因子 TH17細胞作為一種CD4輔助性T細胞，可分泌IL-17、IL-21、IL-22等細胞因子，在維持腸道免疫穩態及抵御外源性病原體感染中發揮重要作用[17]。研究表明，IL-22和IL-17A共同刺激可顯著誘導結腸上皮細胞NGAL mRNA的表達，且腫瘤壞死因子α(TNF-α)可進一步放大這種效應，使NGAL有希望成為判斷抗TNF-α抗體治療炎癥性腸病(IBD)的療效的候選標記物[18]。此外，IL-23/IL-17軸可通過誘導炎癥部位對中性粒細胞的招募，進而促進NGAL在炎癥部位的分泌，增強抗菌及免疫調節作用。NGAL的表達受IL-23R基因型的調控，當增加IL-23R突變基因時，血清NGAL濃度呈明顯下降趨勢，但在用抗IL-23R抗體治療IBD小鼠模型后，NGAL水平逐漸恢復到初始水平，表明基因受損的IL-23軸阻礙了NGAL的正常上調[18]。

3 NGAL與腸道炎癥相關性疾病

3.1NGAL與IBD 黏膜免疫、腸道微生態和宿主易感性在IBD的發病中起重要作用。基因微陣列分析顯示NGAL基因是潰瘍性結腸炎(UC)患者結腸黏膜中表達最豐富的基因之一,也是UC的易感基因；在腸上皮細胞和腸黏膜的中性粒細胞中均有發現NGAL蛋白，而mRNA的合成僅位于上皮細胞，提示結腸黏膜中性粒細胞中的NGAL是由骨髓中未成熟的中性粒細胞前體合成并在炎癥部位釋放；而腸上皮細胞則參與大量NGAL的從頭合成，使上皮細胞作為黏膜防御的一部分直接參與炎癥過程的調節[19]。在小鼠模型中，NGAL的缺失導致結腸細菌黏附蛋白表達上調；糞便細菌數量較前增加3倍，以在IBD更為普遍的擬桿菌屬及腸桿菌屬居多；且NGAL表達缺陷的小鼠結腸炎癥及便血較野生型更顯著[20]。將鼠NGAL導入乳酸菌中產生大量表達NGAL的乳酸菌，在體外環境中，其對異常pH、高濃度膽汁酸、氧化應激的耐受性增強；而小鼠體內實驗中，表達NGAL的乳酸桿菌可以抑制大腸桿菌的生長、降低腸桿菌素的生物活性，并顯示出更好的腸道黏膜保護作用，這一結論表明益生菌產生和分泌NGAL的基因修飾可提高益生菌在治療結腸炎方面的穩定性、有效性[21]。

NGAL目前也被認為是IBD診斷和活動性監測的潛在標記物。少數臨床研究表明，與健康對照或IBS患者相比，IBD患者的腸黏膜、糞便、血清中NGAL明顯升高[22-23]，且腸黏膜及糞便中NGAL濃度與臨床表現活動性及內鏡下病變活動性具有明顯的相關性[24]，敏感性、特異性優于C反應蛋白(CRP)及紅細胞沉降率(ESR)；在克羅思病(CD)中，結腸型患者糞便NGAL水平顯著高于小腸型患者；在UC中，全結腸炎較直腸炎患者糞便NGAL明顯升高[22]。缺鐵性貧血是IBD常見并發癥，盡管靜脈補鐵，但在10個月內超過50%的患者會復發[25]，有研究發現UC和CD中NGAL與鐵濃度之間存在顯著負相關性，一方面與IBD患者長時間的血液損失有關，另一方面與長期潛在的亞臨床炎癥引起IL-6、TNF-α等炎癥因子上調，造成NGAL合成增多導致鐵螯合作用加強有關[24]，因此NGAL可能是診斷炎癥相關性貧血患者缺鐵與否更可靠的潛在標志。

3.2NGAL與腸道腫瘤 慢性炎癥是腸道腫瘤發病的重要機制之一，結腸炎相關癌癥(CAC)的風險隨病程增加而增加，與炎癥的嚴重程度正相關。因此，明確腫瘤相關性炎癥在結直腸癌(CRC)中的作用及調控具有重要意義。大量研究發現在結腸炎、癌前病變和惡性腫瘤中，結腸上皮細胞均可見NGAL的高表達,而正常結腸組織幾乎不表達NGAL[22，26]。但關于NGAL與腸道腫瘤的發生、侵襲轉移之間的關系，目前持兩種觀點。一種觀點認為，NGAL與腫瘤發生、侵襲轉移呈負相關。KIM等[27]通過免疫印跡法檢測NGAL，也證實了NGAL在CRC細胞中的高表達；敲除NGAL基因，可誘導細胞增殖和從上皮到間充質狀態的形態學轉變；此外，CRC細胞中NGAL的下調也增加了細胞遷移和上皮間質轉換，誘導了大量葡萄糖的消耗和乳酸的產生，伴隨著能量代謝相關基因的增加。因此，NGAL對CRC細胞的增殖、上皮間質轉換和能量代謝具有負調控作用，可能是CRC中潛在的轉移抑制因子和治療靶點。這一結論與文獻[28]的研究結果相符，他們發現NGAL/IL-10雙缺陷小鼠的腸道所有黏液層完全喪失，黏膜屏障惡化，附著于腸上皮細胞和隱窩的細菌大量入侵，并以IL6-STAT3依賴的方式促進腸道炎癥-異型增生-腫瘤的發生、發展，而NGAL可防止結腸炎因IL-10缺乏引起的右側結腸腫瘤的自發形成，其機制與微生物菌群的改變有關。另一種觀點認為，NGAL促進腫瘤發生、侵襲轉移。多種腫瘤中NGAL可與MMP9形成復合物，阻止MMP9的降解。MMP9不僅可以直接降解基底膜和基質中的Ⅳ型膠原，同時可以促進細胞外基質釋放血管內皮細胞生長因子，促進腫瘤血管形成、浸潤和遠處轉移[29-30]。HU等[31]發現在人結腸癌細胞中，NGAL過表達通過Racl、E-cadherin和catenins的異位，導致癌細胞的骨架系統重組，減低細胞與細胞之間的黏附，增加細胞與基質之間的黏附，進而提高癌細胞的運動能力，促進癌細胞侵襲轉移。

NGAL在不同腫瘤細胞中功能的差異,可能與腫瘤細胞的類型不同有關，仍需進一步大樣本、更深入的研究。

綜上所述，NGAL與腸道炎癥及腫瘤的發生、發展密切相關，但目前對于NGAL在腸道炎癥及腫瘤方面的具體作用及機制尚有很多不同的觀點。所以，有必要對其展開更加深入的研究，這不僅有利于在基因分子水平上深化NGAL對腸道炎癥及腫瘤發病機制的基礎理論認識，更有利于推進NGAL在IBD及腸道腫瘤中的臨床應用。