丁香假單胞桿菌Avr基因與寄主植物R基因的互作研究進展

黃 喆, 周 靜, 潘素君, 劉 敬, 戴良英, 李 魏*

1.湖南農業大學植物保護學院, 長沙 410128;2.婁底職業技術學院農林工程學院, 湖南 婁底 417000

植物借助先天免疫反應和受侵染部位產生的系統信號抵御病原微生物的入侵。植物先天免疫系統可分為兩大類，一類是由病原物相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)誘導的免疫反應 (PAMP-triggered immunity，PTI)，它構成植物體內免疫反應的第一道防線。另一類是由病原菌效應因子(effector) 激發的免疫反應 (effector-triggered immunity，ETI)，為植物免疫反應的第二道防線。在ETI反應中，效應因子是病原菌為了能夠成功侵染植物，克服寄主細胞自身免疫系統的識別而產生。然而效應因子扮演著雙重角色，既是抗性抑制因子又是抗性誘導因子[1]。丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringae)屬革蘭氏陰性菌，是為害十分廣泛的植物病原細菌，它可以感染植物的地上部分，使植物出現葉斑病、葉片壞死、潰瘍病等疾病[2]。根據該菌侵染寄主植物方式的不同以及所致病害的不同特征，可將丁香假單胞桿菌大約分為64個致病變種，每個致病變種中都有多個效應因子[3]。隨著分子生物學的高速發展，效應因子已成為當前生物學研究的熱門領域之一。本文主要介紹了丁香假單胞桿菌效應因子在植物體內致病和誘導抗性的分子機制，以期對植物抗病機理研究、植物病害防治以及農作物抗性基因與種質資源挖掘、抗病遺傳育種等領域提供參考信息和策略。

1 效應因子的分類

最初，人們把病原菌效應因子理解為一類能夠改變寄主結構與功能的蛋白[4]。因此，效應因子又被稱為效應蛋白[5]。效應因子根據其介導的病原物-寄主植物親和或者不親和互作可分為毒性(Vir)效應因子和無毒(Avr)效應因子。

1.1 丁香假單胞桿菌TTSS系統

病原菌一旦進入寄主細胞間隙，則主要通過分泌系統向宿主細胞內傳遞效應因子[6,7]。植物病原細菌在寄主植物體內的生存方式有賴于其自身分泌的效應因子。目前已發現細菌效應因子的分泌系統共有6類(I～VI)[8,9]。細菌通過寄主植物的自然孔口(例如氣孔)或傷口進入植物并在細胞間隙中增殖，其中一個主要的發病機制是由III型分泌系統(type three secretion system, TTSS)所介導的[10～12]。研究發現植物病原菌的TTSS具有向寄主細胞注射致病性因子、輸出Harpins、運輸效應蛋白的功能[13,14]。因此，TTSS是丁香假單胞桿菌侵染過程中重要的蛋白分泌系統，其由hrp基因編碼[15]。Jin等[16]和Li等[17]研究表明，丁香假單胞桿菌的TTSS系統具有較長的菌毛，該菌毛能夠引導效應蛋白通過植物細胞壁和植物細胞膜或者通過植物質膜。通過該系統，病原菌效應蛋白被直接注入宿主細胞中，對寄主的防御機制起到抑制作用，從而使病原菌在寄主體內得以進一步繁殖和侵染[18,19]。許多丁香假單胞桿菌的III型效應因子(type III effectors, T3Es)是調控植物與病原微生物相互作用的關鍵性因子[20]。這些T3Es中很多具有不同酶活性，包括半胱氨酸蛋白酶(如AvrPphB和AvrRpt2)、單-ADP-核糖基轉移酶(HopU1和HopF2)、磷酸蘇氨酸裂解酶(HopAI1)、E3泛素連接酶(AvrPtoB)和蛋白酪氨酸磷酸酶(HopAO1)等[21,22]，利用這些酶調控寄主植物體內的一系列抗病與感病反應。雖然TTSS的注射和運輸機制仍在探究和摸索之中，但人們已經普遍接受它是植物病原細菌致病和誘導過敏反應過程中所必須的蛋白分泌系統。

1.2 丁香假單胞桿菌毒性效應因子

毒性效應因子，如丁香假單胞桿菌的VirPphA、 HopAI1、 HopM1、HopU1、HopF2等，能以不同的方式破壞植物的免疫系統，它們介導丁香假單胞桿菌與寄主植物間的親和作用[21,23～25]。VirPphA是P.syringaepv.phaseolicola中最早鑒定出具有毒性功能的效應因子[23]，它可以抑制其他效應因子激發宿主產生過敏反應，促進病原微生物加速對宿主的侵染。RIN4是HopF2的主要毒力靶標，HopF2可以通過靶向擬南芥RIN4蛋白以促進丁香假單胞桿菌的毒力，另外HopF2也可以在擬南芥體內與寄主AtMKK5蛋白互作，從而抑制寄主的PTI反應[24,26]。2014年，Block等[27]研究表明丁香假單胞桿菌番茄變種 DC3000的毒性效應因子HopD1通過定位于內質網與宿主膜結合轉錄因子NTL9相互作用來抑制植物的ETI反應。另外，丁香假單胞桿菌效應因子HopAF1、HopB1和HopG1等毒性效應因子可通過阻斷乙烯誘導、特異性地破壞免疫受體BAK1以及促進宿主轉錄抑制因子降解等方式抑制植物的天然免疫系統[28～31]。總之，近年的研究表明丁香假單胞桿菌可以進化出不同的毒性效應因子，以不同的方式干擾或破壞植物的免疫系統，進而侵染宿主細胞。

1.3 丁香假單胞桿菌無毒效應因子

病原物產生的毒性效應因子能夠抑制寄主植物的PTI反應，為克服毒性效應因子的這種抑制作用，植物隨之進化出相應的R蛋白感知病原物分泌的效應因子，激活過敏反應(hypersensitive response, HR)，即ETI。此時的效應因子被稱之為無毒(Avr)效應因子。病原物Avr基因與植物R基因之間的特異性識別與互作是植物實現抗病性的關鍵。第一個克隆到的Avr基因是來源于丁香假單胞桿菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)的avrA基因[32,33]。另外，丁香假單胞桿菌中的Avr基因，如AvrPphB、AvrPto、AvrPtoB、AvrRpm1、AvrRpt2等介導丁香假單胞桿菌與寄主植物間的不親和作用也被人們深入研究。病原物Avr基因進入寄主細胞后，往往會對寄主細胞內的靶標蛋白進行修飾或化學催化，而這種修飾或者化學催化作用會被寄主體內的R蛋白識別進而引起HR。如丁香假單胞桿菌的Avr效應因子AvrRpt2能夠剪切植物蛋白RIN4，從而激活寄主植物體內的R蛋白RPS2，進而啟動基因對基因的抗性[34～36]。而丁香假單胞桿菌的AvrB和AvrRpm1則磷酸化RIN4，被磷酸化修飾的RIN4被寄主植物體內的R蛋白RPM1感應后即激發HR反應[37]。

有意思的是，病原微生物的毒性效應因子與無毒效應因子介導親和作用還是不親和作用并不是絕對的，而是由寄主體內有無相應的R基因決定的。當無毒效應因子對應的寄主體內的R基因缺失或者喪失功能時，無毒效應因子就會變為毒性效應因子，介導親和作用[38]。如丁香假單胞桿菌效應因子AvrRptoB能與番茄抗性基因Pto互作引發HR反應，但在缺失Pto的植物中，AvrRptoB便會抑制寄主植物的程序性壞死反應，促進細菌的生長[39,40]。再如丁香假單胞桿菌III型效應因子AvrRpm1和AvrRpt2在沒有抗性蛋白RPM1和RPS2的情況下通過靶向F-box蛋白COI1依賴性信號傳導途徑來促進細菌毒力[41]。

2 丁香假單胞桿菌效應因子與寄主植物R基因的互作方式

目前，關于丁香假單胞桿菌Avr效應因子和寄主植物體內的R基因的識別方式主要有2種假說，一是直接識別模式，另一種是間接識別模式。

2.1 直接識別模式

直接識別模式又稱受體-配體模型。早期，Harold Flor從遺傳學角度提出了“基因對基因”假說，并且表征了數十種R-Avr基因組合[1,42]。該假說簡而言之就是寄主植物通過其體內的R基因產物直接識別對應的病原微生物的無毒效應因子，進而產生強烈的抗病反應即HR。例如，丁香假單胞桿菌分泌的無毒效應蛋白AvrPto與寄主植物的R蛋白Pto產生直接物理互作進而激發Pto介導的HR[43]。然而，就現有的研究結果來看，人們對于之前被認為是直接識別關系的R-Avr組合又有了新的見解，并且對于許多R-Avr組合，其物理上的相互作用尚未被觀察到，所以這種R-Avr直接識別的方式并不多見。

2.2 間接識別模式

近年來，有大量報道指出植物許多R蛋白與病原物Avr蛋白之間并不發生直接的物理互作，而是通過一種間接的方式進行識別。目前，間接識別模式最常見的有警戒模式 (guard model) 和誘餌模式 (decoy model)兩種。

2.2.1警戒模式 警戒模式即病原物效應因子與寄主植物體內的靶標蛋白(中間蛋白)識別后，對該靶標進行剪切或修飾，R蛋白在監測到中間蛋白的剪切或修飾后被激活，從而觸發寄主的ETI。這種情況下，中間蛋白起到病原物入侵警戒的作用，因此該互作方式被稱為警戒模式[1,44]。警戒模型最初是為了解釋番茄R蛋白Pto和Prf對丁香假單胞桿菌效應因子AvrPto的感知機制[1]。目前有大量研究結果證實了警戒模式，如擬南芥體內的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶PBS1之前一直被認為是R基因，后來有研究證明丁香假單胞桿菌的效應因子AvrPphB本質是半胱氨酸蛋白酶，它首先通過對自己進行剪切激活，再剪切寄主體內的PBS1，寄主體內的R蛋白RPS5在監測到PBS1被剪切后隨即被激活，從而誘導了ETI，出現HR反應[45]。再如上文所提及的效應因子AvrRpt2、AvrRpm1及AvrB磷酸化修飾或剪切它們共同的靶標RIN4后，被修飾過的RIN4至少能夠被RPS2和RPM1這兩種NBS-LRR蛋白監控識別，進而引起HR抗病反應[35]。

警戒模式在一定程度上解釋了一個R蛋白如何識別多個效應因子，這樣的話，植物就能利用相對較小范圍的R基因庫抵御廣泛多樣的病原體[1,46]。但是2005年Chisholm等[47]在其研究報告中指出，效應因子AvrRpt2的靶蛋白并不是專一的，該效應因子不僅能夠裂解RIN4，還能裂解其他可能的靶蛋白。但警戒模式并不能解釋這一現象，因此，該模式的理論缺陷也在此。

2.2.2誘餌模式 2008年Van和Kamoun[48]基于警戒模式提出了誘餌模式。誘餌是指寄主植物中一種在序列或結構上類似于真正靶蛋白的抗病蛋白。可以理解為寄主植物為了抵抗病原物入侵，進化出與病原物效應因子真正靶蛋白的結構與序列相似的假靶標，該假靶標一旦被效應因子錯誤識別后，就會激活R基因介導的HR。值得注意的是，在任何情況下，誘餌模式都意味著R蛋白識別的效應物靶標是誘餌(假靶標)，但該模式并不適用于病原物效應因子缺乏對應的R蛋白這一情況[48]。如丁香假單胞桿菌的效應因子AvrPphB可以通過剪切擬南芥體內的類受體激酶BIK1及其同源蛋白PBLs以發揮其致病作用，植物為此進化出與BIK1和PBLs同源的PBS1蛋白，當效應因子AvrPphB錯誤識別PBS1并切割該蛋白后，立即激活植物體內由RPS5介導的HR反應[49]。又如AvrPto的真正靶標是FLS2和EFR1，植物為避免真正靶標被AvrPto識別，進化出一種類似蛋白激酶，即誘餌蛋白Pto，該蛋白作為中間蛋白競爭性的與效應因子結合，從而引發Prf介導的HR反應[50]。誘餌模式仍有待進一步研究證明，目前尚無具體研究證據對警戒模式和誘餌模式進行確切的劃分。因為這兩個模式不一定是相互排斥的，當警戒模式演變成誘餌模式時，可能會出現中間階段。因此，警戒模式的許多預測也適用于誘餌模式。

3 展望

總體而言，研究效應因子是了解植物抗病分子機制的先決條件，也是植物病理學研究的一個熱點。植物的抗病性和病原物的致病性并不是恒定不變的，在自然選擇的作用下, 病原物為提高它的致病性會不斷產生新的致病效應因子用于攻克植物免疫系統，反過來，植物面對病原物的侵染也會不斷進化出新的抗病基因以增強它的抗病性來抵御病原物[51]。因此，病原物效應因子與寄主之間的互作是不斷進化發展的。目前，雖然人們對這方面的研究日益深入，但仍有許多不清楚的地方，如R基因識別病原微生物效應因子之后是如何激活下游免疫應答的？人們能否設計出廣譜識別Avr基因的R基因？這些問題都有待進一步探究和解釋。

作為模式菌種，深入了解丁香假單胞桿菌效應因子與寄主的互作分子機制、植物的抗病機制以及病原物的致病機制，將對植物抗病機理研究、植物病害防治等領域做出巨大貢獻，同時也有利于挖掘新的抗性基因與抗性種質資源并利用遺傳手段培育優良的抗病植物品種。