柴胡地上部分成分分析及其解熱鎮痛活性研究

袁小晶 程雪丹 余 馬 索志榮 葉 平 秦海燕

(1. 西南科技大學生命科學與工程學院 四川綿陽 621010； 2. 西南科技大學分析測試中心 四川綿陽 621010)

柴胡(BupleurumchinenseD C)屬傘形科柴胡屬,多年生草本植物,其干燥根為傳統中藥,具有鎮靜、止痛、抗菌消炎、保肝利膽、抗病毒等功效。一直以來人們對于柴胡的研究多集中于根部皂苷類成分，但近年不斷有實驗研究發現柴胡地上部分(柴胡莖、葉)也含有多種有效成分[1]?！爸胁?號”為四川德培源中藥科技開發有限公司、中國醫學科學院藥用植物研究所、西南科技大學等單位通過多年努力，選育出通過專業主管權威機構鑒定認證、符合 2015 版 《中國藥典》要求的北柴胡品種，并在四川省廣元市進行了大面積栽培，該公司生產的柴胡根用以入藥，地上部分莖葉棄之不用,造成“中柴2號”柴胡資源大量浪費。

近年來，將中草藥添加于動物飼料以預防疾病或改善畜禽生產性能成為養殖業的研究熱點。宣清良等[2]使用柴胡蒸餾液治療妊娠母豬的持續高熱，取得了良好效果。彭國海[3]使用柴胡細辛煎汁治療豬的感冒，可以有效緩解感冒癥狀，降低體溫，提高攝食量。目前柴胡地上部分應用于畜牧生產的研究不多，從其藥用和營養的雙重作用來看，其應用于緩解畜禽熱應激和提高機體免疫力有著廣泛的應用前景[4]。本論文對“中柴2 號”柴胡地上部分的化學成分進行定性和定量分析，并測試其解熱鎮痛活性，以期為柴胡地上部分應用于動物飼料或動物疾病治療提供理論依據，也為擴大柴胡的藥用部位提供理論支持。

1 實驗

1.1 材料與方法

雌雄小白鼠(SPFKM品系)各80只，質量(20±2 g)，由成都達碩實驗動物有限公司提供。

“中柴2號”柴胡購自四川德培源中藥科技開發有限公司，產地綿陽安縣花荄鎮、廣元青川縣竹園鎮、馬鹿鄉。

蘆丁、槲皮素、山奈素、異鼠李鼠，購自中國藥品生物制品檢定所；柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d，購自成都普菲德生物技術有限公司；乙腈、甲醇，購自Fisher公司；LPS購自上海依赫生物科技有限公司。

旋轉蒸發器(R-301)，購自于上海申順生物科技有限公司；液相色譜儀(ULtiMate 3000 DGLG)，購自中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 色譜條件

HypesiL GOLD色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫程序(0～5 min，10%～30%A；5～25 min，70%A)；流速為0.8 mL·min-1；柱溫檢測為30 ℃，進樣量10 μL，運行時間25 min，檢測波長210 nm。

1.3 供試品溶液的制備

精密稱取柴胡細粉1.0 g，加入甲醇溶液50 mL，密塞，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)30 min，過濾，用甲醇20 mL分兩次洗滌容器和藥渣，洗液與濾液合并，減壓旋蒸，加甲醇溶解并轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

1.4 線性關系考察

吸取制備的混合標準品儲備溶液，稀釋，制得濃度分別為初始濃度的1/250，1/50，1/20，1/5，1/1的混合對照品溶液，各取10 μL注入色譜儀中測定，按上述色譜條件依次進樣測定峰面積，以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，得到線性回歸方程。

1.5 解熱實驗(內毒素致熱)

取實驗用小鼠30只，于實驗前置于恒溫的適應環境中。實驗前測定小鼠的肛溫，并挑選出18只體溫在38 ℃以下且體溫體重接近的小鼠，并將其平均分為3組，分別為柴胡組、模型組、空白對照組。

柴胡組和模型組小鼠分別腹腔注射LPS溶液0.2 mL，使其發熱，空白對照組小鼠腹腔注射0.2 mL蒸餾水；柴胡組小鼠灌胃15 mg·mL-1柴胡煎煮液0.2 mL，剩余兩組灌胃等量蒸餾水，每隔0.5 h測一次肛溫，持續測量180 min，以基礎體溫為基數，計算各測定時間點小鼠體溫變化ΔT(℃)。以時間為橫坐標，ΔT為縱坐標繪制體溫變化曲線，計算各個實驗組在體溫達到峰值后的下降幅度[5]。

1.6 鎮痛實驗(熱板法)

選取24只舔足時間在40 s以下的雌鼠，平均分為3組，分別為低劑量(10 mg·mL-1)、中劑量(15 mg·mL-1)和高劑量(20 mg·mL-1)組，記錄基礎舔足時間，并給其進行腹腔注射對應濃度的柴胡煎煮液0.2 mL。于10,30,60 min后測量痛閾值，計算痛閾抑制率。痛閾抑制率(%)=(給藥后痛閾值-給藥前痛閾值)/給藥前痛閾值×100%[5]。

2 結果與討論

2.1 柴胡地上部分含量測定結果

柴胡中黃酮與皂苷標準品及供試品HPLC色譜圖如圖1所示。

圖1 混合對照品和樣品的色譜圖

根據柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、蘆丁、槲皮素、異鼠李素、山柰素的回歸方程，計算發現“中柴2號”柴胡地上部分含有較高的黃酮類成分和少量的皂苷類成分，黃酮類成分含量范圍為2.01～8.75 mg·g-1，其皂苷類成分含量0.103～0.459 mg·g-1。其中黃酮類化合物對人體腫瘤、衰老、心血管等疾病的治療和預防有重要意義[6]，由此可知，“中柴2號”柴胡地上部分亦有顯著的藥用價值。

2.2 解熱作用

如圖2，表1、表2所示，各組小鼠腹腔注射LPS后，1.5～2.5 h達到峰值，與基礎體溫比較，除空白對照組外，各組小鼠體溫變化均大于0.6 ℃，表明造模成功。計算給藥組小鼠體溫變化ΔT(T1.5 h與T3.0 h體溫差值)、T1.5 h(T1.5 h與基礎體溫差值)。計算體溫下降幅度(%)=ΔT/ΔT1.5 h×100%，模型組和柴胡組體溫下降與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05),表明柴胡地上部分煎煮液有顯著的解熱作用。張云波等[7]研究表明，柴胡黃酮部分和其他物質在解熱效應中發揮重要作用，能協同增強解熱效果。說明“中柴2號”柴胡地上部分黃酮類成分在發熱動物的解熱中發揮了作用。

圖2 各組小鼠不同時間的體溫變化趨勢

表1 各組小鼠不同時間的體溫

表2 各組小鼠體溫的下降幅度(n=6)

2.3 鎮痛作用

表3表明，不同濃度的柴胡地上部分煎煮液的鎮痛效果不同。后續試驗選擇濃度為15 mg·mL-1的柴胡地上部分煎煮液。

表3 不同濃度煎煮液在不同給藥時間后的鎮痛作用

表4表明，與空白組對照，柴胡地上部分煎煮液鎮痛作用顯著，且隨著注射時間的增長，柴胡地上部分的鎮痛效果在一定范圍內呈遞增趨勢，其中給藥30 min后鎮痛效果最好,0～1 h內達到峰值。這是因為柴胡地上部分含有柴胡皂苷等水溶性成分，對神經系統有明顯的抑制作用，從而發揮良好的鎮痛作用[8]。

表4 熱板法試驗結果(n=6)

3 結論

“中柴2號”柴胡地上部分含有較高的黃酮類成分，含量范圍2.01～8.75 mg·g-1，皂苷類成分含量達0.103～0.459 mg·g-1，而且其鎮痛效果在一定范圍內呈遞增趨勢， 0～1 h內達到峰值，說明柴胡地上部分可以作為藥用植物資源加以充分利用。中草藥飼料添加劑毒副作用小、不易產生抗藥性，是一種具有營養作用和抗病作用的綠色飼料添加劑。柴胡地上部分產量大，取材方便，地上部分用于動物飼料添加劑或獸醫臨床應用可以在一定程度上減少化學藥品出現的耐藥性或者器官毒性等問題。廣元市已推廣“中柴2號”約667 hm2，深入研究如何正確合理地使用柴胡地上部分作為中草藥飼料添加劑，不僅對動物疾病預防與控制發揮十分明顯的積極作用，也極大提高了中藥柴胡的經濟效益。